ヒト多能性幹細胞からの網膜オルガノイドの誘導
Summary
自己組織化法を用いて、光受容体の生成を大幅に増加させる可能性のあるCOCOを添加したプロトコルを開発します。
Abstract
網膜細胞移植は有望な治療アプローチであり、網膜構造を回復し、変性した網膜の視覚能力を安定または改善する可能性があります。それにもかかわらず、細胞補充療法の進歩は現在、高品質で標準化されたヒト網膜の既製の供給源を必要とするという課題に直面しています。したがって、実験には簡単で安定したプロトコルが必要です。ここでは、外因性分子と試薬Aを用いた自己組織化法と、3次元ヒト網膜オルガノイド(RO)を作製するための手動切除法に基づいて、最適化されたプロトコルを開発します。ヒト多能性幹細胞(PSC)由来のROは、光受容体に特異的なマーカーを発現します。多機能アンタゴニストであるCOCOを添加すると、視細胞前駆体および錐体の分化効率が大幅に向上します。細胞株と初代細胞の利点を持ち、後者に関連する調達の問題なしに、このシステムを効率的に使用することで、コンフルエントな網膜細胞、特に光受容体を生成することができます。したがって、PSCからROへの分化は、疾患モデリング、薬物スクリーニング、および細胞移植のための最適で生物学的に関連するプラットフォームを提供します。
Introduction
多能性幹細胞(PSC)は、自己複製とあらゆる種類の体細胞への分化能力を特徴としています。このように、PSC由来のオルガノイドは再生医療研究において重要な資源となっています。網膜変性は、光受容体(桿体および錐体)および網膜色素上皮の喪失を特徴とする。網膜細胞置換は、この病気の有望な治療法になる可能性があります。しかし、疾患の研究や治療のためにヒト網膜を入手することは現実的ではありません。したがって、多層の天然網膜細胞を効果的かつ首尾よく再現するPSC由来の網膜オルガノイド(RO)は、基礎研究およびトランスレーショナル研究に有益です1,2,3。私たちの研究は、網膜変性を研究するための十分で質の高い細胞を提供するためにRO分化に焦点を当てています4。
ROを微分する方法は絶えず出現しており、2012年に笹井研究室によって3次元(3D)懸濁液分化が開拓されました5。ヒト胚性幹細胞(hESC)にCRX-tdTomatoタグを導入して視細胞前駆細胞を特異的に追跡し、Wnt、TGF-β、およびBMP経路の多機能アンタゴニストであるCOCOを添加して方法を変更しました6。COCOは、光受容体前駆体および錐体の分化効率を効率的に改善することが示されている6、7。
全体として、古典的な分化法を変更することにより、ヒトROから豊富な光受容体前駆体および錐体を収集し、実験室での調査を通じて光受容体に関連する網膜疾患を分析し、さらなる臨床応用/移植を行うためのアクセス可能なプロトコルを開発しました。
Protocol
Representative Results
Discussion
網膜オルガノイドの分化は、十分な機能的な網膜細胞を生成するための望ましい方法です。このROは、神経網膜に向かう多能性幹細胞によって生成される神経節細胞、双極細胞、および光受容体などの異なる網膜細胞の複合体である4、5、8、9。コンフルエントなROを採取することはできますが、?…
Acknowledgements
502研究室のメンバーの技術サポートと原稿に関する有益なコメントに感謝します。この研究の一部は、北京市自然科学基金会(Z200014)および中国国家重点研究開発プログラム(2017YFA0105300)の支援を受けました。
Materials
| 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| COCO | R&D Systems | 3047-CC-050 | DAN Domain family of BMP antagonists |
| DMEM/F-12 | Gibco | 10565-042 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| DPBS | Gibco | C141905005BT | |
| EDTA | Thermo | 15575020 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem Cells | Biological Industry | 04-002-1A | |
| GMEM | Gibco | 11710-035 | |
| KnockOut Serum Replacement-Multi-Species | Gibco | A3181502 | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X) | sigma | M7145 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Primesurface 96 V-plate | Sbio | MS9096SZ | Cell aggregation in 1.2.7 |
| Pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Reagent A | BD | 356231 | Matrigel in 1.1.1 |
| Reagent B | StemCell | 5990 | mTeSR- E8 , PSCs basal medium in 1.1.2 |
| Reagent C | Gibco | 12563-011 | TrypLE Express in 1.2 |
| Reagent D | Roche | 11284932001 | DNase I , in 1.2 |
| Retinoic acid | Sigma | R2625-100MG | |
| SAG | Enzo Life Science | ALX-270-426-M001 | |
| Supplement 1 | Life Technologies | 17502-048 | N-2 Supplement (100X), Liquid, supplemet in medum III |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | organoids dissociation in 2.1.3 |
| Wnt Antagonist I, IWR-1-endo – Calbiochem | Sigma | 681669 | Wnt inhibitor |
| Y-27632 2HCl | Selleck | S1049 |
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