Rettet induksjon av retinale organoider fra humane pluripotente stamceller
Summary
Ved hjelp av en selvorganiserende metode utvikler vi en protokoll med tillegg av kokos som kan øke genereringen av fotoreceptorer betydelig.
Abstract
Retinalcelletransplantasjon er en lovende terapeutisk tilnærming, som kan gjenopprette retinalarkitekturen og stabilisere eller til og med forbedre de visuelle evnene til den degenererte netthinnen. Likevel står fremgang i celleutskiftningsterapi for tiden overfor utfordringene ved å kreve en hyllevare kilde av høy kvalitet og standardiserte humane netthinner. Derfor er det nødvendig med en enkel og stabil protokoll for forsøkene. Her utvikler vi en optimalisert protokoll, basert på en selvorganiserende metode med bruk av eksogene molekyler og reagens A, samt manuell eksisjon for å generere tredimensjonale humane retinaorganoider (RO). Den humane Pluripotent Stem Cells (PSCs) -avledet RO uttrykker spesifikke markører for fotoreceptorer. Med tilsetning av COCO, en multifunksjonell antagonist, økes differensieringseffektiviteten til fotoreceptorforløpere og kjegler betydelig. Effektiv bruk av dette systemet, som har fordelene med cellelinjer og primære celler, og uten innkjøpsproblemer forbundet med sistnevnte, kan produsere sammenflytende retinale celler, spesielt fotoreceptorer. Dermed gir differensieringen av PSC til RO en optimal og biorelevant plattform for sykdomsmodellering, legemiddelscreening og celletransplantasjon.
Introduction
Pluripotente stamceller (PSC) er preget av deres selvfornyelse og evne til å differensiere til alle slags somatiske celler. Dermed har organoider avledet fra PSC blitt en viktig ressurs i regenerativ medisinforskning. Retinal degenerasjon er preget av tap av fotoreceptorer (stenger og kjegler) og retinal pigmentepitel. Retinal celle erstatning kan være en oppmuntrende behandling for denne sykdommen. Det er imidlertid ikke mulig å skaffe menneskelige netthinner for sykdomsforskning og terapi. Derfor er retinale organoider (ROs) avledet fra PSC, som effektivt og vellykket rekapitulerer flerlags innfødte retinale celler, gunstige for grunnleggende og translasjonell forskning 1,2,3. Vår forskning fokuserer på RO-differensiering for å gi tilstrekkelige og kvalitetsceller for å studere retinal degenerasjon4.
Metoder for differensiering av ROer dukker stadig opp, med tredimensjonal (3D) suspensjonsdifferensiering som ble utviklet av Sasai-laboratoriet i 20125. Vi introduserte CRX-tdTomato-taggen i humane embryonale stamceller (hESCs) for spesifikt å spore fotoreseptorforløpercellene og modifiserte metoden med tillegg av COCO, en multifunksjonell antagonist av Wnt-, TGF-β- og BMP-banene6. Kokos har vist seg å effektivt forbedre differensieringseffektiviteten til fotoreseptorforløpere og kjegler 6,7.
Til sammen, ved å modifisere den klassiske differensieringsmetoden, har vi utviklet en tilgjengelig protokoll for å høste rikelig fotoreceptorforløpere og kjegler fra humane ROs for å analysere retinal sykdom assosiert med fotoreceptorene gjennom laboratorieundersøkelser og for videre klinisk anvendelse / transplantasjon.
Protocol
Representative Results
Discussion
Retinal organoid differensiering er en ønskelig metode for generering av rikelig funksjonelle retinale celler. RO er en sammensetning av forskjellige retinale celler, som ganglionceller, bipolare celler og fotoreceptorer, generert av pluripotente stamceller mot nevrale retina 4,5,8,9. Selv om sammenflytende ROs kan høstes, er det tidkrevende, noe som kan kreve lange dyrkingsperioder (opptil 1…
Acknowledgements
Vi takker medlemmer av 502 laboratorium for teknisk støtte og nyttige kommentarer angående manuskriptet. Dette arbeidet ble delvis støttet av Beijing Municipal Natural Science Foundation (Z200014) og National Key R&D Program of China (2017YFA0105300).
Materials
| 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| COCO | R&D Systems | 3047-CC-050 | DAN Domain family of BMP antagonists |
| DMEM/F-12 | Gibco | 10565-042 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| DPBS | Gibco | C141905005BT | |
| EDTA | Thermo | 15575020 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem Cells | Biological Industry | 04-002-1A | |
| GMEM | Gibco | 11710-035 | |
| KnockOut Serum Replacement-Multi-Species | Gibco | A3181502 | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X) | sigma | M7145 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Primesurface 96 V-plate | Sbio | MS9096SZ | Cell aggregation in 1.2.7 |
| Pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Reagent A | BD | 356231 | Matrigel in 1.1.1 |
| Reagent B | StemCell | 5990 | mTeSR- E8 , PSCs basal medium in 1.1.2 |
| Reagent C | Gibco | 12563-011 | TrypLE Express in 1.2 |
| Reagent D | Roche | 11284932001 | DNase I , in 1.2 |
| Retinoic acid | Sigma | R2625-100MG | |
| SAG | Enzo Life Science | ALX-270-426-M001 | |
| Supplement 1 | Life Technologies | 17502-048 | N-2 Supplement (100X), Liquid, supplemet in medum III |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | organoids dissociation in 2.1.3 |
| Wnt Antagonist I, IWR-1-endo – Calbiochem | Sigma | 681669 | Wnt inhibitor |
| Y-27632 2HCl | Selleck | S1049 |
References
- Xie, H., et al. Chromatin accessibility analysis reveals regulatory dynamics of developing human retina and hiPSC-derived retinal organoids. Science Advances. 6 (6), 5247 (2020).
- Lu, Y. F., et al. Single-Cell Analysis of Human Retina Identifies Evolutionarily Conserved and Species-Specific Mechanisms Controlling Development. Developmental Cell. 53 (4), 473-491 (2020).
- Cowan, C. S., et al. Cell Types of the Human Retina and Its Organoids at Single-Cell Resolution. Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).
- Jin, Z. B., et al. Stemming retinal regeneration with pluripotent stem cells. Progress in Retinal and Eye Research. 69, 38-56 (2019).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
- Pan, D., et al. COCO enhances the efficiency of photoreceptor precursor differentiation in early human embryonic stem cell-derived retinal organoids. Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 366 (2020).
- Zhou, S., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into cone photoreceptors through simultaneous inhibition of BMP, TGFbeta and Wnt signaling. Development. 142 (19), 3294-3306 (2015).
- Deng, W. L., et al. Gene Correction Reverses Ciliopathy and Photoreceptor Loss in iPSC-Derived Retinal Organoids from Retinitis Pigmentosa Patients. Stem Cell Reports. 10 (4), 1267-1281 (2018).
- Gao, M. L., et al. Patient-Specific Retinal Organoids Recapitulate Disease Features of Late-Onset Retinitis Pigmentosa. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 128 (2020).
- Zhang, C. J., Ma, Y., Jin, Z. B. The road to restore vision with photoreceptor regeneration. Experimental Eye Research. 202, 108283 (2020).
- Reichman, S., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U. S. A. 111 (23), 8518-8523 (2014).
- Kuwahara, A., et al. Generation of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue. Nature Communications. 6, 6286 (2015).
