Riktad induktion av retinala organoider från humana pluripotenta stamceller
Summary
Med hjälp av en självorganiserande metod utvecklar vi ett protokoll med tillägg av COCO som avsevärt kan öka genereringen av fotoreceptorer.
Abstract
Retinalcellstransplantation är ett lovande terapeutiskt tillvägagångssätt som kan återställa retinalarkitekturen och stabilisera eller till och med förbättra de visuella egenskaperna hos den degenererade näthinnan. Icke desto mindre står framsteg inom cellersättningsterapi för närvarande inför utmaningarna att kräva en färdig källa av högkvalitativa och standardiserade mänskliga näthinnor. Därför behövs ett enkelt och stabilt protokoll för experimenten. Här utvecklar vi ett optimerat protokoll, baserat på en självorganiserande metod med användning av exogena molekyler och reagens A samt manuell excision för att generera de tredimensionella mänskliga näthinneorganoiderna (RO). De humana pluripotenta stamcellerna (PSC) -härledda RO uttrycker specifika markörer för fotoreceptorer. Med tillsats av COCO, en multifunktionell antagonist, ökar differentieringseffektiviteten hos fotoreceptorprekursorer och kottar avsevärt. Den effektiva användningen av detta system, som har fördelarna med cellinjer och primära celler, och utan de inköpsproblem som är förknippade med det senare, kan producera sammanflytande retinala celler, särskilt fotoreceptorer. Differentieringen av privata säkerhetsföretag till RO ger således en optimal och biorelevant plattform för sjukdomsmodellering, läkemedelsscreening och celltransplantation.
Introduction
Pluripotenta stamceller (PSC) kännetecknas av deras självförnyelse och förmåga att differentiera till alla typer av somatiska celler. Således har organoider som härrör från PSC blivit en viktig resurs i regenerativ medicinforskning. Retinal degeneration kännetecknas av förlust av fotoreceptorer (stavar och kottar) och retinal pigmentepitel. Retinal cellbyte kan vara en uppmuntrande behandling för denna sjukdom. Det är dock inte möjligt att få mänskliga näthinnor för sjukdomsforskning och terapi. Därför är retinala organoider (ROs) härledda från PSC, som effektivt och framgångsrikt rekapitulerar flerskiktiga infödda retinala celler, fördelaktiga för grundläggande och translationell forskning 1,2,3. Vår forskning fokuserar på RO-differentiering för att ge tillräckliga och kvalitetsceller för att studera retinal degeneration4.
Metoder för att differentiera ROs växer kontinuerligt fram, med tredimensionell (3D) suspensionsdifferentiering som var banbrytande av Sasai-laboratoriet 20125. Vi introducerade CRX-tdTomato-taggen i de mänskliga embryonala stamcellerna (hESC) för att specifikt spåra fotoreceptorprekursorcellerna och modifierade metoden med tillägg av COCO, en multifunktionell antagonist för Wnt-, TGF-β- och BMP-vägarna6. COCO har visat sig effektivt förbättra differentieringseffektiviteten hos fotoreceptorprekursorer och kottar 6,7.
Sammantaget har vi, genom att modifiera den klassiska differentieringsmetoden, utvecklat ett tillgängligt protokoll för att skörda rikliga fotoreceptorprekursorer och kottar från mänskliga ROs för att analysera näthinnesjukdomen associerad med fotoreceptorerna genom laboratorieundersökningar och för ytterligare klinisk tillämpning / transplantation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Retinal organoid differentiering är en önskvärd metod för generering av rikliga funktionella retinala celler. RO är en sammansättning av olika retinala celler, såsom ganglionceller, bipolära celler och fotoreceptorer, genererade av pluripotenta stamceller mot den neurala näthinnan 4,5,8,9. Även om sammanflytande ROs kan skördas är det tidskrävande, vilket kan kräva långa odlingsp…
Acknowledgements
Vi tackar medlemmarna i 502-laboratoriet för deras tekniska support och hjälpsamma kommentarer angående manuskriptet. Detta arbete stöddes delvis av Beijing Municipal Natural Science Foundation (Z200014) och National Key R&D Program of China (2017YFA0105300).
Materials
| 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| COCO | R&D Systems | 3047-CC-050 | DAN Domain family of BMP antagonists |
| DMEM/F-12 | Gibco | 10565-042 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| DPBS | Gibco | C141905005BT | |
| EDTA | Thermo | 15575020 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem Cells | Biological Industry | 04-002-1A | |
| GMEM | Gibco | 11710-035 | |
| KnockOut Serum Replacement-Multi-Species | Gibco | A3181502 | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X) | sigma | M7145 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Primesurface 96 V-plate | Sbio | MS9096SZ | Cell aggregation in 1.2.7 |
| Pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Reagent A | BD | 356231 | Matrigel in 1.1.1 |
| Reagent B | StemCell | 5990 | mTeSR- E8 , PSCs basal medium in 1.1.2 |
| Reagent C | Gibco | 12563-011 | TrypLE Express in 1.2 |
| Reagent D | Roche | 11284932001 | DNase I , in 1.2 |
| Retinoic acid | Sigma | R2625-100MG | |
| SAG | Enzo Life Science | ALX-270-426-M001 | |
| Supplement 1 | Life Technologies | 17502-048 | N-2 Supplement (100X), Liquid, supplemet in medum III |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | organoids dissociation in 2.1.3 |
| Wnt Antagonist I, IWR-1-endo – Calbiochem | Sigma | 681669 | Wnt inhibitor |
| Y-27632 2HCl | Selleck | S1049 |
References
- Xie, H., et al. Chromatin accessibility analysis reveals regulatory dynamics of developing human retina and hiPSC-derived retinal organoids. Science Advances. 6 (6), 5247 (2020).
- Lu, Y. F., et al. Single-Cell Analysis of Human Retina Identifies Evolutionarily Conserved and Species-Specific Mechanisms Controlling Development. Developmental Cell. 53 (4), 473-491 (2020).
- Cowan, C. S., et al. Cell Types of the Human Retina and Its Organoids at Single-Cell Resolution. Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).
- Jin, Z. B., et al. Stemming retinal regeneration with pluripotent stem cells. Progress in Retinal and Eye Research. 69, 38-56 (2019).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
- Pan, D., et al. COCO enhances the efficiency of photoreceptor precursor differentiation in early human embryonic stem cell-derived retinal organoids. Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 366 (2020).
- Zhou, S., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into cone photoreceptors through simultaneous inhibition of BMP, TGFbeta and Wnt signaling. Development. 142 (19), 3294-3306 (2015).
- Deng, W. L., et al. Gene Correction Reverses Ciliopathy and Photoreceptor Loss in iPSC-Derived Retinal Organoids from Retinitis Pigmentosa Patients. Stem Cell Reports. 10 (4), 1267-1281 (2018).
- Gao, M. L., et al. Patient-Specific Retinal Organoids Recapitulate Disease Features of Late-Onset Retinitis Pigmentosa. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 128 (2020).
- Zhang, C. J., Ma, Y., Jin, Z. B. The road to restore vision with photoreceptor regeneration. Experimental Eye Research. 202, 108283 (2020).
- Reichman, S., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U. S. A. 111 (23), 8518-8523 (2014).
- Kuwahara, A., et al. Generation of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue. Nature Communications. 6, 6286 (2015).
