मानव CRISPR-इंजीनियर कार-टी कोशिकाओं का उत्पादन
Summary
यहां, हम कार-टी कोशिकाओं को संशोधित करने के लिए CRISPR कैस प्रौद्योगिकी का उपयोग करके प्राथमिक मानव टी कोशिकाओं में जीन संपादन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं ।
Abstract
क दत्तक कोशिका चिकित्सा चिमरिक एंटीजन रिसेप्टर टी कोशिकाओं (कार-टी कोशिकाओं) का उपयोग कर हेमेटोलॉजिकल घातक के साथ रोगियों में उल्लेखनीय नैदानिक प्रभावकारिता का प्रदर्शन किया है और वर्तमान में विभिन्न ठोस ट्यूमर के लिए जांच की जा रही है । कार-टी कोशिकाओं को एक मरीज के रक्त से टी कोशिकाओं को हटाने और उन्हें इंजीनियरिंग करने के लिए एक सिंथेटिक प्रतिरक्षा रिसेप्टर है कि टी कोशिकाओं को पहचानने और लक्ष्य ट्यूमर कोशिकाओं को खत्म करने के लिए redirects व्यक्त करने के द्वारा उत्पन्न कर रहे हैं । कार-टी कोशिकाओं के जीन संपादन में वर्तमान कार-टी सेल चिकित्सा की सुरक्षा में सुधार करने और कार-टी कोशिकाओं की प्रभावकारिता को और बढ़ाने की क्षमता है । यहां, हम मानव CRISPR-इंजीनियर CD19 निर्देशित कार-टी कोशिकाओं की सक्रियता, विस्तार और लक्षण वर्णन के तरीकों का वर्णन करते हैं। इसमें कार लेंटीवायरल वेक्टर का लेनदेन और टी कोशिकाओं में रुचि के जीन को लक्षित करने के लिए एकल गाइड आरएनए (एसजीआरएनए) और Cas9 एंडोन्यूलेज का उपयोग शामिल है। इस प्रोटोकॉल में वर्णित तरीकों को सार्वभौमिक रूप से इस अध्ययन के लिए उपयोग किए जाने वाले लोगों से परे अन्य कार निर्माण और लक्ष्य जीन पर लागू किया जा सकता है। इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल ग्रेना डिजाइन, लीड जीआरएनए चयन और नैदानिक ग्रेड मानव टी कोशिकाओं के उच्च दक्षता, मल्टीप्लेक्स CRISPR-Cas9 इंजीनियरिंग को पुन: उत्पन्न करने के लिए जीन नॉकआउट सत्यापन के लिए रणनीतियों पर चर्चा करता है।
Introduction
चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर (सीएआर) -टी सेल थेरेपी ने दत्तक कोशिका चिकित्सा और कैंसर इम्यूनोथेरेपी के क्षेत्र में क्रांति ला दी है। कार-टी-कोशिकाएं एक सिंथेटिक प्रतिरक्षा रिसेप्टर को व्यक्त करने वाली टी-कोशिकाओं को इंजीनियर करती हैं जो टीसीआर्ज़ेटा श्रृंखला से प्राप्त संकेत डोमेन के साथ एक एंटीजन-विशिष्ट एकल श्रृंखला एंटीबॉडी टुकड़े को जोड़ती है और टी-सेल सक्रियण और सह-उत्तेजना1,2,3,4 के लिए आवश्यक और पर्याप्त डोमेन है। . कार-टी कोशिकाओं का निर्माण रोगी की अपनी टी-कोशिकाओं को निकालने से शुरू होता है, जिसके बाद कार मॉड्यूल के पूर्व वीवो वायरल ट्रांसडक्शन और चुंबकीय मोतियों के साथ कार-टी सेल उत्पाद का विस्तार होता है जो कृत्रिम एंटीजन पेश कोशिकाओं के रूप में कार्य करता है5। विस्तारित कार-टी कोशिकाओं को रोगी में फिर से संचार किया जाता है जहां वे एनग्रेफ्ट कर सकते हैं, लक्षित ट्यूमर कोशिकाओं को खत्म कर सकते हैं और यहां तक किजलसेक6,7,8के बाद कई वर्षों तक बने रहते हैं। हालांकि कार-टी सेल थेरेपी बी-सेल घातक में उल्लेखनीय प्रतिक्रिया दरों में हुई है, ठोस ट्यूमर के लिए नैदानिक सफलता गरीब टी सेल घुसपैठ9,एक इम्यूनोसप्रेसिव ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट10,एंटीजन कवरेज और विशिष्टता, और कार-टी सेल शिथिलता11,12 सहित कई कारकों द्वारा चुनौती दी गई है . वर्तमान कार-टी सेल थेरेपी की एक और सीमा में ऑटोलॉगस टी-कोशिकाओं का उपयोग शामिल है। कीमोथेरेपी और उच्च ट्यूमर बोझ के कई दौर के बाद, कार-टी कोशिकाओं के समय और autologous कार टी कोशिकाओं के निर्माण के साथ जुड़े खर्च के अलावा स्वस्थ दाताओं से एलोजेनिक कार टी उत्पादों की तुलना में खराब गुणवत्ता की हो सकती है । CRISPR/Cas9 द्वारा कार-टी सेल उत्पाद का जीन-संपादन कार-टी कोशिकाओं13, 14, 15,16,17की वर्तमान सीमाओं को दूर करने के लिए एक नई रणनीति का प्रतिनिधित्व करता है ।
CRISPR/Cas9 एक दो घटक प्रणाली है जिसका उपयोग स्तनधारी कोशिकाओं18,19में लक्षित जीनोम संपादन के लिए किया जा सकता है । CRISPR से जुड़े एंडो न्यूक्लियीज Cas9 लक्ष्य डीएनए अनुक्रम20के साथ आधार-बांधना के माध्यम से छोटे आरएनए द्वारा निर्देशित साइट-विशिष्ट डबल-स्ट्रैंड ब्रेक को प्रेरित कर सकता है । मरम्मत टेम्पलेट के अभाव में, डबल-स्ट्रैंड ब्रेक की मरम्मत त्रुटि प्रवण गैर-होम्योपैथी अंत जुड़ने (एनएचईजे) मार्ग द्वारा की जाती है, जिसकेपरिणामस्वरूप 19,20,21के दौरान डालने और विलोपन म्यूटेशन (INDELs) के माध्यम से फ्रेमशिफ्ट म्यूटेशन या समय से पहले बंद हो जाते हैं। दक्षता, उपयोग में आसानी, लागत प्रभावशीलता और मल्टीप्लेक्स जीनोम संपादन की क्षमता CRISPR/Cas9 को ऑटोलॉगस और एलोजेनिक कार-टी कोशिकाओं की प्रभावकारिता और सुरक्षा को बढ़ाने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण बनाती है । इस दृष्टिकोण का उपयोग टीसीआर के साथ कार निर्माण को बदलकर टीसीआर निर्देशित टी कोशिकाओं को संपादित करने के लिए भी किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, एलोजेनिक कार-टी कोशिकाओं जिनमें भ्रष्टाचार बनाम मेजबान रोग पैदा करने की सीमित क्षमता है, उन्हें टीसीआर, बी2एम और एचएलए लोकस के जीन संपादन द्वारा भी उत्पन्न किया जा सकता है।
इस प्रोटोकॉल में, हम दिखाते हैं कि कैसे टी कोशिकाओं के CRISPR-इंजीनियरिंग को बढ़ी हुई प्रभावकारिता और सुरक्षा के साथ जीनोम-संपादित कार-टी सेल उत्पादों को उत्पन्न करने के लिए कार-ट्रांसजीन के वायरल वेक्टर मध्यस्थता वितरण के साथ जोड़ा जा सकता है। पूरी प्रक्रिया का एक योजनाबद्ध आरेख चित्र 1 में दिखाया गयाहै । इस दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, हमने प्राथमिक मानव कार-टी कोशिकाओं में उच्च दक्षता वाले जीन नॉकआउट का प्रदर्शन किया है। चित्रा 2A टी कोशिकाओं के संपादन और विनिर्माण के लिए प्रत्येक चरण की समयरेखा का विस्तार से वर्णन करता है। गाइड आरएनए डिजाइन और नॉकआउट सत्यापन के लिए रणनीतियों पर भी विभिन्न लक्ष्य जीन के लिए इस दृष्टिकोण को लागू करने पर चर्चा कर रहे हैं ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां हम CRISPR Cas9 प्रौद्योगिकी का उपयोग कर कार-टी कोशिकाओं को संपादित करने और कार्य और प्रभावकारिता के लिए आगे परीक्षण करने के लिए उत्पादों का निर्माण करने के लिए दृष्टिकोण का वर्णन करते हैं। उपरोक्त प्रो?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम सामान्य दाता टी कोशिकाओं और पेंसिल्वेनिया विश्वविद्यालय में प्रवाह साइटोमेट्री कोर प्रदान करने के लिए मानव इम्यूनोलॉजी कोर स्वीकार करते हैं ।
Materials
| 4D-Nucleofactor Core Unit | Lonza | AAF-1002B | |
| 4D-Nucleofactor X-Unit | Lonza | AAF-1002X | |
| Accuprime Pfx Supermix | ThermoFisher | 12344040 | |
| Beckman Optima XPN ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody | Biolegend | 317322 | Clone OKT3 |
| BV711 Anti-human PD1 | Biolegend | Clone EH12.2H7 | |
| Cas9-Electroporation enhancers | IDT | 1075915 | |
| CD3/CD28 Dynabeads | ThermoFisher | 40203D | |
| CD4+ T cell isolation Kit | StemCell technologies | 15062 | |
| CD8+ T cell isolation Kit | StemCell technologies | 15063 | |
| Corning 0.45 micron vacuum filter/bottle | Corning | 430768 | |
| Corning T150 cell culture flask | Millipore Sigma | CLS430825 | |
| DMSO | Millipore Sigma | D2650 | |
| DNAeasy Blood and Tissue Kit | Qiagen | 69504 | |
| DynaMag Magnet | ThermoFisher | 12321D | |
| Glutamax supplement | ThermoFisher | 35050061 | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| HEPES (1 M) | ThermoFisher | 15630080 | |
| huIL-15 | PeproTech | 200-15 | |
| huIL-7 | PeproTech | 200-07 | |
| Lipofectamine 2000 | ThermoFisher | 11668019 | |
| Nucleospin Gel and PCR cleanup | Takara | 740609.25 | |
| Opti-MEM | ThermoFisher | 31985062 | |
| P3 Primary cell 4D-nucleofactor X Kit L | Lonza | V4XP-3024 | |
| Penicilin-Streptomycin-Glutamine | ThermoFisher | 10378016 | |
| pTRPE expression Plasmid | in house | ||
| Rabbit Anti-Mouse FMC63 scFv Monoclonal Antibody, (R19M), PE | CytoArt | 200105 | |
| RPMI1640 | ThermoFisher | 12633012 | |
| sgRNA | IDT | ||
| Spy Fi Cas9 | Aldevron | 9214 | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| Viral packaging mix | in house | ||
| X-Vivo-15 Media | Lonza | BE02-060F |
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