Produção de células CAR-T projetadas por CRISPR humanas
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para edição de genes em células T humanas primárias usando a tecnologia CRISPR Cas para modificar células CAR-T.
Abstract
Terapias celulares adotivas usando células T do receptor de antígeno quimérico (células CAR-T) demonstraram notável eficácia clínica em pacientes com malignidades hematológicas e estão atualmente sendo investigadas para vários tumores sólidos. As células CAR-T são geradas removendo células T do sangue de um paciente e projetando-as para expressar um receptor imunológico sintético que redireciona as células T para reconhecer e eliminar células tumorais alvo. A edição de genes das células CAR-T tem o potencial de melhorar a segurança das terapias atuais de células CAR-T e aumentar ainda mais a eficácia das células CAR-T. Aqui, descrevemos métodos para ativação, expansão e caracterização de células CAR-T direcionadas por CRISPR. Isso compreende a transdução do vetor lentiviral CAR e o uso de RNA guia único (sgRNA) e Cas9 endonuclease para atingir genes de interesse em células T. Os métodos descritos neste protocolo podem ser universalmente aplicados a outras construções car e genes-alvo além dos utilizados neste estudo. Além disso, este protocolo discute estratégias para o design de gRNA, seleção de gRNA de chumbo e validação de genes-alvo para alcançar de forma reproduibivelmente alta eficiência, engenharia multiplex CRISPR-Cas9 de células T humanas de grau clínico.
Introduction
A terapia celular quimérico de antígeno (CAR)-T revolucionou o campo das terapias celulares adotivas e da imunoterapia contra o câncer. As células CAR-T são células T projetadas expressando um receptor imunológico sintético que combina um fragmento de anticorpo de cadeia única específico de antígeno com domínios de sinalização derivados da cadeia TCRzeta e domínios costimulatórios necessários e suficientes para ativação e co-estimulação de células T1,2,3,4 . A fabricação de células CAR-T começa extraindo as próprias células T do paciente, seguida pela transdução viral ex vivo do módulo CAR e expansão do produto celular CAR-T com contas magnéticas que funcionam como antígenos artificiais apresentando células5. As células CAR-T expandidas são reinfundidas no paciente onde podem engrafar, eliminar células tumorais alvo e até persistir por vários anos após a infusão6,7,8. Embora a terapia celular CAR-T tenha resultado em taxas notáveis de resposta em malignidades de células B, o sucesso clínico para tumores sólidos tem sido desafiado por múltiplos fatores, incluindo a má infiltração de células T9,um microambiente tumoral imunossupressor10,cobertura e especificidade de antígenos, e disfunção celular CAR-T11,12 . Outra limitação da terapia celular CAR-T atual inclui o uso de células T autólogas. Após várias rodadas de quimioterapia e alta carga tumoral, as células CAR-T podem ser de má qualidade em comparação com produtos CAR-T aogeneicos de doadores saudáveis, além do tempo e despesas associados à fabricação de células CAR-T autólogas. A edição de genes do produto car-t por CRISPR/Cas9 representa uma nova estratégia para superar as limitações atuais das células CAR-T13,14,15,16,17.
CRISPR/Cas9 é um sistema de dois componentes que pode ser usado para edição de genomas direcionados em células de mamíferos18,19. O Endonuclease Cas9 associado ao CRISPR pode induzir quebras de dois fios específicas do local guiadas por pequenos RNAs através do emparelhamento de base com a sequência de DNAalvo 20. Na ausência de um modelo de reparo, as quebras de dois fios são reparadas pela via de junção final nonhomologous propensa a erros (NHEJ), resultando em mutações de mudança de quadro ou codons de parada prematura através de mutações de inserção e exclusão (INDELs)19,20,21. Eficiência, facilidade de uso, custo-efetividade e a capacidade de edição de genoma multiplex fazem do CRISPR/Cas9 uma ferramenta poderosa para aumentar a eficácia e a segurança das células CAR-T autólogas e aogenéticas. Essa abordagem também pode ser usada para editar células T direcionadas tcr substituindo a construção do CAR por um TCR. Além disso, células CAR-T aogenéticas que têm potencial limitado para causar enxerto versus doença hospedeira também podem ser geradas pela edição de genes do lócus TCR, b2m e HLA.
Neste protocolo, mostramos como a engenharia CRISPR de células T pode ser combinada com a entrega mediada por vetores virais do CAR-Transgene para gerar produtos celulares CAR-T editados por genoma com maior eficácia e segurança. Um diagrama esquemático de todo o processo é mostrado na Figura 1. Usando essa abordagem, demonstramos um nocaute genético de alta eficiência nas células CAR-T humanas primárias. A Figura 2A descreve em detalhes a linha do tempo de cada etapa para edição e fabricação de células T. Estratégias para o design de RNA guia e validação de nocaute também são discutidas para aplicar essa abordagem a vários genes-alvo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui descrevemos abordagens para editar células CAR-T de genes usando a tecnologia CRISPR Cas9 e fabricar produtos para testar melhor a função e eficácia. O protocolo acima foi otimizado para a realização da edição de genes CRIPSR em células T humanas primárias combinadas com células T de engenharia com receptores de antígeno quimérico. Este protocolo permite alta eficiência de nocaute com variabilidade mínima de doador para doador. A modificação usando CRISPR pode melhorar tanto a eficácia quanto a seg…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconhecemos o Núcleo de Imunologia Humana por fornecer células T doadoras normais e o Núcleo de Citometria de Fluxo da Universidade da Pensilvânia.
Materials
| 4D-Nucleofactor Core Unit | Lonza | AAF-1002B | |
| 4D-Nucleofactor X-Unit | Lonza | AAF-1002X | |
| Accuprime Pfx Supermix | ThermoFisher | 12344040 | |
| Beckman Optima XPN ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody | Biolegend | 317322 | Clone OKT3 |
| BV711 Anti-human PD1 | Biolegend | Clone EH12.2H7 | |
| Cas9-Electroporation enhancers | IDT | 1075915 | |
| CD3/CD28 Dynabeads | ThermoFisher | 40203D | |
| CD4+ T cell isolation Kit | StemCell technologies | 15062 | |
| CD8+ T cell isolation Kit | StemCell technologies | 15063 | |
| Corning 0.45 micron vacuum filter/bottle | Corning | 430768 | |
| Corning T150 cell culture flask | Millipore Sigma | CLS430825 | |
| DMSO | Millipore Sigma | D2650 | |
| DNAeasy Blood and Tissue Kit | Qiagen | 69504 | |
| DynaMag Magnet | ThermoFisher | 12321D | |
| Glutamax supplement | ThermoFisher | 35050061 | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| HEPES (1 M) | ThermoFisher | 15630080 | |
| huIL-15 | PeproTech | 200-15 | |
| huIL-7 | PeproTech | 200-07 | |
| Lipofectamine 2000 | ThermoFisher | 11668019 | |
| Nucleospin Gel and PCR cleanup | Takara | 740609.25 | |
| Opti-MEM | ThermoFisher | 31985062 | |
| P3 Primary cell 4D-nucleofactor X Kit L | Lonza | V4XP-3024 | |
| Penicilin-Streptomycin-Glutamine | ThermoFisher | 10378016 | |
| pTRPE expression Plasmid | in house | ||
| Rabbit Anti-Mouse FMC63 scFv Monoclonal Antibody, (R19M), PE | CytoArt | 200105 | |
| RPMI1640 | ThermoFisher | 12633012 | |
| sgRNA | IDT | ||
| Spy Fi Cas9 | Aldevron | 9214 | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| Viral packaging mix | in house | ||
| X-Vivo-15 Media | Lonza | BE02-060F |
References
- Kowolik, C. M., et al. CD28 costimulation provided through a CD19-specific chimeric antigen receptor enhances in vivo persistence and antitumor efficacy of adoptively transferred T cells. Recherche en cancérologie. 66 (22), 10995-11004 (2006).
- Krause, A., et al. Antigen-dependent CD28 signaling selectively enhances survival and proliferation in genetically modified activated human primary T lymphocytes. The Journal of Experimental Medicine. 188 (4), 619-626 (1998).
- Kuwana, Y., et al. Expression of chimeric receptor composed of immunoglobulin-derived V resions and T-cell receptor-derived C regions. Biochemical and biophysical research Communications. 149 (3), 960-968 (1987).
- Maher, J., Brentjens, R. J., Gunset, G., Rivière, I., Sadelain, M. Human T-lymphocyte cytotoxicity and proliferation directed by a single chimeric TCRζ/CD28 receptor. Nature Biotechnology. 20 (1), 70-75 (2002).
- Levine, B. L., Miskin, J., Wonnacott, K., Keir, C. Global manufacturing of CAR-T cell therapy. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 4, 92-101 (2017).
- Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene ciloleucel CAR-T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).
- Porter, D. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia. Science Translational Medicine. 7 (303), 139 (2015).
- Maude, S. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).
- Melero, I., Rouzaut, A., Motz, G. T., Coukos, G. T-cell and NK-cell infiltration into solid tumors: a key limiting factor for efficacious cancer immunotherapy. Cancer Discovery. 4 (5), 522-526 (2014).
- Mohammed, S., et al. Improving chimeric antigen receptor-modified T cell function by reversing the immunosuppressive tumor microenvironment of pancreatic cancer. Molecular Therapy. 25 (1), 249-258 (2017).
- Moon, E. K., et al. Multifactorial T-cell hypofunction that is reversible can limit the efficacy of chimeric antigen receptor-transduced human T cells in solid tumors. Clinical Cancer Research. 20 (16), 4262-4273 (2014).
- Beatty, G. L., O’Hara, M. Chimeric antigen receptor-modified T cells for the treatment of solid tumors: defining the challenges and next steps. Pharmacology & Therapeutics. 166, 30-39 (2016).
- Stadtmauer, E. A., et al. CRISPR-engineered T cells in patients with refractory cancer. Science. 367 (6481), (2020).
- MacLeod, D. T., et al. Integration of a CD19 CAR into the TCR alpha chain locus streamlines production of allogeneic gene-edited CAR-T cells. Molecular Therapy. 25 (4), 949-961 (2017).
- Ren, J., et al. Multiplex genome editing to generate universal CAR-T cells resistant to PD1 inhibition. Clinical Cancer Research. 23 (9), 2255-2266 (2017).
- Ureña-Bailén, G., et al. CRISPR/Cas9 technology: towards a new generation of improved CAR-T cells for anticancer therapies. Briefings in Functional Genomics. 19 (3), 191-200 (2020).
- Li, C., Mei, H., Hu, Y. Applications and explorations of CRISPR/Cas9 in CAR-T-cell therapy. Briefings in Functional Genomics. 19 (3), 175-182 (2020).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. Elife. 2, 00471 (2013).
- Schluns, K. S., Kieper, W. C., Jameson, S. C., Lefrançois, L. Interleukin-7 mediates the homeostasis of naive and memory CD8 T cells in vivo. Nature Immunology. 1 (5), 426-432 (2000).
- Prlic, M., Lefrancois, L., Jameson, S. C. Multiple choices: regulation of memory CD8 T cell generation and homeostasis by interleukin (IL)-7 and IL-15. The Journal of Experimental Medicine. 195 (12), 49-52 (2002).
- Zhou, J., et al. Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cells expanded with IL-7/IL-15 mediate superior antitumor effects. Protein & Cell. 10 (10), 764-769 (2019).
- Hultquist, J. F., et al. CRISPR-Cas9 genome engineering of primary CD4+ T cells for the interrogation of HIV-host factor interactions. Nature Protocols. 14 (1), 1-27 (2019).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), 168 (2014).
