Bepaling van totale lipide- en lipideklassen in mariene monsters
Summary
Dit protocol is voor de bepaling van lipiden in zeewater en biologische specimens. Lipiden in filtraten worden geëxtraheerd met chloroform of mengsels van chloroform en methanol in het geval van vaste stoffen. Lipideklassen worden gemeten door staaf dunnelaagchromatografie met vlamionisatiedetectie en hun som geeft het totale lipidengehalte.
Abstract
Lipiden bestaan grotendeels uit koolstof en waterstof en leveren daarom een grotere specifieke energie dan andere organische macromoleculen in de zee. Omdat ze koolstof- en waterstofrijk zijn, zijn ze ook hydrofoob en kunnen ze fungeren als een oplosmiddel en absorptiedrager voor organische verontreinigingen en kunnen ze dus aanjagers zijn van verontreinigende bioaccumulatie in mariene ecosystemen. Hun hydrofobe aard vergemakkelijkt hun isolatie van zeewater of biologische monsters: mariene lipidenanalyse begint met bemonstering en vervolgens extractie in niet-polaire organische oplosmiddelen, wat een handige methode biedt voor hun scheiding van andere stoffen in een aquatische matrix.
Als zeewater is bemonsterd, bestaat de eerste stap meestal uit scheiding in operationeel gedefinieerde ‘opgeloste’ en ‘deeltjes’ facties door filtratie. Monsters worden verzameld en lipiden geïsoleerd uit de monstermatrix, meestal met chloroform voor echt opgeloste materie en colloïden, en met mengsels van chloroform en methanol voor vaste stoffen en biologische monsters. Dergelijke extracten kunnen verschillende klassen bevatten uit biogene en antropogene bronnen. Op dit moment kunnen de totale lipiden- en lipidenklassen worden bepaald. Het totale lipide kan worden gemeten door individueel bepaalde lipideklassen op te tellen die gewoonlijk chromatografisch zijn gescheiden. Thin-layer chromatography (TLC) met vlamionisatiedetectie (FID) wordt regelmatig gebruikt voor de kwantitatieve analyse van lipiden uit mariene monsters. TLC-FID levert synoptische lipideklasse-informatie en, door klassen op te tellen, een totale lipidenmeting.
Informatie over lipidenklassen is vooral nuttig in combinatie met metingen van individuele componenten, bijvoorbeeld vetzuren en / of sterolen, na hun afgifte uit lipide-extracten. De grote verscheidenheid aan lipidestructuren en -functies betekent dat ze breed worden gebruikt in ecologisch en biogeochemisch onderzoek dat de gezondheid van ecosystemen en de mate van invloed door antropogene effecten beoordeelt. Ze zijn gebruikt om stoffen met een voedingswaarde voor de mariene fauna te meten (bijv. Aquafeeds en / of prooien) en als een indicator van de waterkwaliteit (bijv. Koolwaterstoffen).
Introduction
De hier beschreven methoden hebben betrekking op stoffen die operationeel worden gedefinieerd als mariene lipiden. Deze definitie is gebaseerd op hun vatbaarheid voor vloeistof-vloeistofextractie in niet-polaire organische oplosmiddelen en biedt een handige methode voor hun scheiding van andere stoffen in een aquatische matrix. Hun hydrofobe aard vergemakkelijkt hun isolatie van zeewater of biologische exemplaren, evenals hun verrijking en de verwijdering van zouten en eiwitten.
Het meten van het lipidengehalte en de samenstelling ervan in mariene organismen is al tientallen jaren van groot belang in voedselwebecologie, aquacultuurvoeding en voedingswetenschap. Lipiden zijn universele componenten in levende organismen, die fungeren als essentiële moleculen in celmembranen, als belangrijke bronnen van biologisch beschikbare energie, thermische isolatie en drijfvermogen bieden en dienen als signaalmoleculen. Hoewel procedures voor lipidenbepaling op andere gebieden goed zijn beschreven, vereist het gebruik ervan met mariene monsters gewoonlijk modificatie om zich aan te passen aan veldomstandigheden en om type1te bemonsteren.
Voor zeewatermonsters vereist de eerste stap meestal scheiding in de operationeel gedefinieerde ‘opgeloste’ en ‘deeltjes’ fracties, normaal gesproken door filtratie (protocolstap 1). De deeltjesfractie is wat wordt vastgehouden door het filter en de grootte van de poriën is belangrijk bij het definiëren van de afsnijding2. Vaak willen we bij het bemonsteren van fijnstof lipideconcentraties relateren aan totale massaconcentraties, in welk geval hiervoor een apart, kleiner monster (bijv. 10 ml) moet worden genomen (protocolstap 1, opmerking). Om een nauwkeurige massabepaling te krijgen, is het belangrijk om ammoniumformium (35 g / L) toe te voegen aan het einde van de filtratie.
Het zeewaterfiltraat uit het grotere monster moet tussen 250 ml en 1 l bedragen, afhankelijk van het type monster en wordt onderworpen aan vloeistof-vloeistofextractie in een separatortrechter (protocolstap 2). De hydrofobe aard van lipiden betekent dat ze kunnen worden gescheiden van andere verbindingen door extractie in een niet-polair oplosmiddel zoals chloroform. Er wordt een tweelaags systeem gecreëerd waarbij lipiden zich opdelen in de organische laag terwijl wateroplosbare componenten in de waterige laag blijven.
Deeltjesmonsters op een filter, of biologische monsters worden geëxtraheerd met een gemodificeerde Folch et al. extractie3, ook met chloroform (Protocol stap 3). Nogmaals, een organisch / waterig systeem wordt gecreëerd waarin lipiden zich verdelen in de organische fase, terwijl in water oplosbare moleculen in de waterige fase blijven en eiwitten worden neergeslagen. In feite gebruiken de meeste laboratoria voor vaste stoffen een variatie op de Folch et al. extractie3-procedure met chloroform en methanol. Voor filters is de eerste stap om te homogeniseren in 2 ml chloroform en 1 ml methanol.
Tijdens de extractie moet ervoor worden gezorgd dat lipiden worden beschermd tegen chemische of enzymatische modificatie, door monsters en oplosmiddelen op ijs te houden om esterbindingshydrolyse of koolstof-koolstof dubbele bindingsoxidatie te verminderen. Weefsels en cellipiden worden vrij goed beschermd door natuurlijke antioxidanten en door compartimentering4; na de homogenisatie van monsters wordt de celinhoud echter gecombineerd, waardoor lipiden meer vatbaar zijn voor verandering, chemisch of enzymatisch. Sommige lipiden, zoals de meeste sterolen, zijn zeer stabiel, terwijl andere, zoals die met meervoudig onverzadigde vetzuren, gevoeliger zijn voor chemische oxidatie. Anderen, zoals sterolen met geconjugeerde dubbele bindingen, zijn gevoelig voor oxidatie gekatalyseerd door licht5. Na extracties zijn lipiden veel gevoeliger voor chemische oxidatie en moeten monsters worden opgeslagen onder een inert gas zoals stikstof. Een zachte stroom stikstof zou ook worden gebruikt om extracten te concentreren.
Na concentratie zouden lipiden dan normaal gesproken in bulk worden gekwantificeerd, omdat ze een belangrijk onderdeel zijn van mariene ecosystemen die een hoge concentratie energie leveren, meer dan twee keer de kJ / g koolhydraten en eiwitten. Steevast zouden ze vervolgens worden gekwantificeerd als afzonderlijke componenten: de uitgebreide analyse van lipiden omvat over het algemeen scheiding in eenvoudigere categorieën, afhankelijk van hun chemische aard. Een volledige analyse omvat dus het meten van totale lipiden, lipidenklassen en individuele verbindingen.
Het totale lipide kan worden bepaald door de som te nemen van individueel gemeten lipideklassen gescheiden door chromatografie6. Een marien lipidenextract kan meer dan een dozijn klassen bevatten uit biogene en antropogene bronnen. De grote verscheidenheid aan lipidestructuren betekent dat veel informatie kan worden verkregen door individuele groepen van structuren te bepalen. Lipideklassen afzonderlijk, of in bepaalde groepen, zijn gebruikt om de aanwezigheid van bepaalde soorten organismen aan te geven, evenals hun fysiologische status en activiteit2. Ze zijn ook gebruikt als een indicator van de oorsprong van organisch materiaal, waaronder opgelost organisch materiaal (DOM) en hydrofobe verontreinigingen.
Triacylglycerolen, fosfolipiden en sterolen behoren tot de belangrijkere biogene lipidenklassen. De eerste twee zijn biochemisch verwant omdat ze een glycerol-ruggengraat bezitten waaraan twee of drie vetzuren zijn veresterd(figuur 1). Triacylglycerolen zijn samen met wasesters zeer belangrijke opslagstoffen, terwijl andere vetzuurbevattende lipideklassen zoals diacylglycerolen, vrije vetzuren en monoacylglycerolen over het algemeen minder belangrijke bestanddelen zijn. Vrije vetzuren zijn in lagere concentraties aanwezig in levende organismen, omdat de onverzadigde vetzuren giftig kunnen zijn7. Sterolen (zowel in hun vrije als veresterde vormen) en vetalcoholen behoren ook tot de minder polaire lipiden, terwijl glycolipiden en fosfolipiden polaire lipiden zijn. Polaire lipiden hebben een hydrofiele groep, die de vorming van lipide bilayers in celmembranen mogelijk maakt. Vrije sterolen zijn ook structurele componenten van het membraan en wanneer ze in verhouding tot triacylglycerolen worden ingenomen, bieden ze een conditie of voedingsindex (TAG: ST) die op grote schaal is gebruikt8. Wanneer ze in verhouding tot fosfolipiden (ST: PL) worden ingenomen, kunnen ze worden gebruikt om de gevoeligheid van de plant voor zout aan te geven: hogere waarden behouden de structurele integriteit en verminderen de membraandoorlaatbaarheid9. De inverse van deze verhouding (PL: ST) is bestudeerd in tweekleppige weefsels tijdens temperatuuraanpassing10.
Mariene lipideklassen kunnen worden gescheiden door dunnelaagchromatografie (TLC) op silicagel gecoate staven (Protocol stap 4) en vervolgens worden gedetecteerd en gekwantificeerd door vlamionisatiedetectie (FID) in een automatische FID-scanner. TLC / FID is routinematig gebruikt voor mariene monsters omdat het snel synoptische lipideklassegegevens van kleine monsters levert, en door de som van alle klassen te nemen, een waarde voor totale lipiden. TLC/FID is onderworpen aan een kwaliteitsborgingsbeoordeling (QA) en bleek te voldoen aan de normen die vereist zijn voor consistente externe kalibratie, lage blanco’s en nauwkeurige replicatieanalyse11. Variatiecoëfficiënten (CV) of relatieve standaardafwijkingen liggen rond de 10%, en de totale lipidengegevens van de FID-scanner zijn normaal gesproken ongeveer 90% van die verkregen door gravimetrische en andere methoden2. Gravimetrie geeft een hoger totaal aan lipiden waarschijnlijk omdat de FID-scanner alleen niet-vluchtige stoffen meet, en ook als gevolg van mogelijke opname van niet-lipide materiaal in gravimetrische metingen.
De informatie die wordt verstrekt door lipidenklasseanalyse is vooral nuttig in combinatie met bepalingen van vetzuren als individuen, of sterolen, of de twee in combinatie. De eerste stap naar deze analyses omvat de afgifte van alle samenstellende vetzuren samen met sterolen in de lipide-extracten (Protocol stap 5). De grote verscheidenheid aan lipidestructuren en -functies betekent dat ze op grote schaal zijn gebruikt in ecologische en biogeochemische studies die de gezondheid van ecosystemen beoordelen en de mate waarin ze zijn beïnvloed door antropogene en terrestrische inputs. Ze zijn gebruikt om de biosynthese van stoffen met een voedingswaarde voor de mariene fauna te meten en om de kwaliteit van watermonsters aan te geven. Het meten van lipiden in sedimentkernmonsters helpt de gevoeligheid van sedimenten voor veranderingen in menselijk landgebruik in de buurt van de land-zeerand aan te tonen.
Het belangrijkste hulpmiddel voor het identificeren en kwantificeren van individuele lipideverbindingen is van oudsher gaschromatografie (GC) met FID. Vóór de analyse worden deze verbindingen echter vluchtiger gemaakt door derivatisatie. Vetzuren komen vrij in aanwezigheid van een zure katalysator (H2SO4) uit acyllipideklassen (Figuur 1). In de organische chemie is de acylgroep (R-C=O) meestal afgeleid van een carbonzuur (R-COOH). Ze worden vervolgens opnieuw veresterd tot vetzuurmethylesters (FAME), wat betere scheidingen op GC-kolommen geeft (protocolstap 5).
Protocol
Representative Results
Discussion
De snelheid waarmee het TLC-FID-systeem synoptische lipideklasse-informatie van kleine monsters biedt, maakt TLC-FID een geschikt hulpmiddel voor het screenen van mariene monsters voordat meer betrokken analytische procedures worden uitgevoerd. Dergelijke analyses vereisen meestal het vrijkomen van componentverbindingen uit lipide-extracten en derivatisatie om de volatiliteit in het geval van gaschromatografie te verhogen. TLC-FID in combinatie met GC-FID is een krachtige combinatie gebleken voor extracten van zeevruchte…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd gefinancierd door het subsidienummer van de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) 105379 aan C.C. Parrish. Het Core Research Equipment & Instrument Training (CREAIT) Network van Memorial University heeft bijgedragen aan de financiering van deze publicatie.
Materials
| 15 ml vials | VWR | 66009-560 | |
| 1-hexadecanol | Sigma | 258741-1G | |
| 1-Monopalmitoyl-rac-glycerol | Sigma | M1640-1g | |
| 2 ml vials | VWR | 46610-722 | |
| 25 mm glass fibre filters | Fisher | 09 874 32A | |
| 2ml pipet bulbs | VWR | 82024-554 | |
| 47 mm glass fibre filters | Fisher | 09 874 32 | |
| 5 3/4" pipets | Fisher | 1367820A | |
| 9" pipets | Fisher | 1367820C | |
| Acetone | VWR | CAAX0116-1 | |
| Agilent GC-FID 6890 | Agilent | ||
| Calcium Chloride ANHS 500gm | VWR | CACX0160-1 | |
| Caps for 2 ml vials | VWR | 46610-712 | |
| chloroform | VWR | CACX1054-1 | |
| Cholesteryl palmitate | Sigma | C6072-1G | |
| Chromarod S5 | Shell USA | 3252 | |
| Dichloromethane | VWR | CADX0831-1 | |
| DL-a-phosphatidylcholine, dipalmotoyl | Sigma | P5911-1g | |
| Ethyl Ether, ACS grade anhydr 4L | VWR | CAEX0190-4 | |
| Glyceryl tripalmitate | Sigma | T5888-100MG | |
| Hamilton Syringe 702SNR 25µl | Sigma | 58381 | |
| Helium | Air Liquide | A0492781 | |
| Hexane | VWR | CAHX0296-1 | |
| Hydrogen regulator | VWR | 55850-484 | |
| Iatroscan MK6 | Shell USA | ||
| Kimwipes | Fisher | 066662 | |
| Medical Air | Air Liquide | A0464563 | |
| Medium nitrile gloves | Fisher | 191301597C | |
| Nitrile gloves L | VWR | CA82013-782 | |
| Nitrogen | Air Liquide | A0464775 | |
| Nitrogen Regulator | VWR | 55850-474 | |
| Nonadecane | Sigma | 74158-1G | |
| Palmitic acid | Sigma | P0500-10G | |
| Repeating dispenser | Sigma | 20943 | |
| Sodium Bicarbonate 1kg | VWR | CA97062-460 | |
| Sodium Sulfate Anhy ACS 500gr | VWR | CA71008-804 | |
| Sulfuric acid | VWR | CASX1244-5 | |
| Teflon tape | Fisher | 14610120 | |
| tissue master 125 115V w/7mm homogenator | OMNI International | TM125-115 | |
| TLC development tank | Shell USA | 3201 | |
| UHP hydrogen | Air Liquide | A0492788 | |
| VWR solvent repippetter | VWR | 82017-766 | |
| VWR timer Flashing LED 2 channel | VWR | 89140-196 | |
| Zebron ZB-Wax GC column | Phenomenex | 7HM-G013-11 |
References
- Couturier, L. I. E., et al. State of art and best practices for fatty acid analysis in aquatic sciences. ICES Journal of Marine Science. , (2020).
- Parrish, C. C. Lipids in Marine Ecosystems. ISRN Oceanography. , 604045 (2013).
- Folch, J., Lees, M., Stanley, G. H. S. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. Journal of Biological Chemistry. 226, 497-509 (1957).
- Vaz, F. M., Pras-Raves, M., Bootsma, A. H., van Kampen, A. H. C. Principles and practice of lipidomics. Journal of Inherited Metabolic Disease. , (2014).
- Wolf, C., Quinn, P. J. Lipidomics: practical aspects and applications. Progress in Lipid Research. 47, 15-36 (2008).
- Parrish, C. C., Arts, M. T., ainman, B. C. Determination of total lipid, lipid classes, and fatty acids in aquatic samples. Lipids in Freshwater Ecosystems. , 4-20 (1999).
- Jüttner, F. Liberation of 5,8,11,14,17-eicosapentaenoic acid and other polyunsaturated fatty acids from lipids as a grazer defense reaction in epilithic diatom biofilms. Journal of Phycology. 37, 744-755 (2001).
- Carreón-Palau, L., Parrish, C. C., Pérez-España, H., Aguiñiga-Garcia, S. Elemental ratios and lipid classes in a coral reef food web under river influence. Progress in Oceanography. 164, 1-11 (2018).
- Maciel, E., et al. Bioprospecting of marine macrophytes using MS-based lipidomics as a new approach. Marine Drugs. 14, 49 (2016).
- Pernet, F., Tremblay, R., Comeau, L., Guderley, H. Temperature adaptation in two bivalve species from different thermal habitats: energetics and remodelling of membrane lipids. Journal of Experimental Biology. 210, 2999-3014 (2007).
- Bergen, B. J., Quinn, J. G., Parrish, C. C. Quality-assurance study of marine lipid-class determination using Chromarod/Iatroscan thin-layer chromatography-flame ionization detector. Environmental Toxicology and Chemistry. 19, 2189-2197 (2000).
- Foroutani, B. M., Parrish, C. C., Wells, J., Taylor, R. G., Rise, M. L. Minimizing marine ingredients in diets of farmed Atlantic salmon (Salmo salar): effects on liver and head kidney lipid class, fatty acid and elemental composition. Fish Physiology & Biochemistry. 46, 2331-2353 (2020).
- Parrish, C. C., Deibel, D., Thompson, R. J. Effect of sinking spring phytoplankton blooms on lipid content and composition in suprabenthic and benthic invertebrates in a cold ocean coastal environment. Marine Ecology Progress Series. 391, 33-51 (2009).
- Sinanoglou, V. J., et al. On the combined application of Iatroscan TLC-FID and GC-FID to identify total, neutral, and polar lipids and their fatty acids extracted from foods. ISRN Chromatography. , 59024 (2013).
- Peters-Didier, J., Sewell, M. A. Maternal investment and nutrient utilization during early larval development of the sea cucumber Australostichopus mollis. Marine Biology. 164, 178 (2017).
- Triesch, N., et al. Concerted measurements of lipids in seawater and on submicron aerosol particles at the Cape Verde Islands: biogenic sources, selective transfer and high enrichments. Atmospheric Chemistry and Physics. 21, 4267-4283 (2021).
- Parrish, C. C., Bodennec, G., Gentien, P. Determination of glycoglycerolipids by Chromarod thin-layer chromatography with Iatroscan flame ionization detection. Journal of Chromatography A. 741, 91-97 (1996).
- Mejri, S., et al. Bonefish (Albula vulpes) oocyte lipid class and fatty acid composition related to their development. Environmental Biology of Fishes. 102, 221-232 (2019).
- Sewell, M. A. Utilization of lipids during early development of the sea urchin Evechinus chloroticus. Marine Ecology Progress Series. 304, 133-142 (2005).
- Parrish, C. C., Bodennec, G., Gentien, P. Separation of polyunsaturated and saturated lipids from marine phytoplankton on silica gel coated Chromarods. Journal of Chromatography A. 607, 97-104 (1992).
- Stevens, C. J., Deibel, D., Parrish, C. C. Incorporation of bacterial fatty acids and changes in a wax ester-based omnivory index during a long-term incubation experiment with Calanus glacialis Jaschnov. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 303, 135-156 (2004).
- Goutx, M., et al. Short term summer to autumn variability of dissolved lipid classes in the Ligurian Sea (NW Mediterranean). Biogeosciences. 6, 1229-1246 (2009).
- Conlan, J. A., Rocker, M. M., Francis, D. S. A. comparison of two common sample preparation techniques for lipid and fatty acid analysis in three different coral morphotypes reveals quantitative and qualitative differences. PeerJ. 5, 3645 (2017).
