استئصال الهيباتيك الجزئي في سمك الحمار الوحشي البالغ
Summary
يصف هذا البروتوكول إجراء إزالة الفص البطني للكبد في سمك الحمار الوحشي البالغ لتمكين دراسة تجديد الكبد.
Abstract
فشل الكبد هو واحد من الأسباب الرئيسية للوفاة في جميع أنحاء العالم، والوفيات الناجمة عن أمراض الكبد المزمنة ترتفع بشكل حاد في الولايات المتحدة. الكبد السليم قادر على تجديد من الأضرار السامة، ولكن في أمراض الكبد المتقدمة، وضعف القدرة الطبيعية للكبد لتجديد. وقد برزت حمار وحشي كنظام تجريبي قوي لدراسة التجديد. وهي نموذج مثالي لدراسة تجديد الكبد من استئصال الكبد الجزئي، وهو إجراء له صلة سريرية مباشرة تتم فيه إزالة جزء من الكبد جراحيا، تاركا الباقي سليما. لا يوجد بروتوكول قياسي لاستئصال الهيباتيك الجزئي؛ وقد استخدمت الدراسات السابقة باستخدام هذا النموذج بروتوكولات مختلفة قليلا وأفادت نتائج متباينة. الموصوفة هنا هو كفاءة، بروتوكول استنساخها لإجراء استئصال الهيباتيك الجزئي في حمار وحشي الكبار. نحن نستخدم هذه التقنية لإثبات أن حمار وحشي قادر على تجديد غير متبلور للفص المكروب. يمكن استخدام هذا البروتوكول لمزيد من الاستجواب الآليات اللازمة لتجديد الكبد في حمار وحشي.
Introduction
من بين الأعضاء الصلبة في البشر ، والكبد هو الجهاز الوحيد القادر على تجديد1. وهذا أمر بالغ الأهمية، كما الكبد هو جهاز أساسي، المسؤولة عن وظائف التمثيل الغذائي الرئيسية، وتخزين الطاقة، وإزالة السموم من الدم، وإفراز بروتينات البلازما، وإنتاج الصفراء2. يتم استبدال خلايا الكبد المفقودة بسبب الأضرار السامة أو الالتهابية في المقام الأول عن طريق تقسيم خلايا الكبد المتبقية1. نموذج تجريبي كلاسيكي واحد لدراسة تجديد الكبد هو استئصال الكبد الجزئي ، حيث تتم إزالة الفصوص الفردية للكبد ، وترك الفصوص المتبقية سليمة3. تم تطوير هذا الإجراء في البداية في الفئران ، حيث تتم إزالة ما يقرب من ثلثي كتلة الكبد. بعد استئصال الكبد الجزئي في الثدييات ، يحدث التجديد التعويضي في الفصوص المتبقية حتى يستعيد الكبد كتلته الأولية. وتجدر الإشارة إلى أن كبد الثدييات لا يحل محل الفصوص المفقودة.
Zebrafish (دانيو rerio) تمثل نموذجا قابلة للسحب لدراسة تجديد الأعضاء الكبار4. الكبد حمار وحشي، في حين تختلف هيكليا عن الكبد الثدييات، و تتكون من نفس أنواع الخلايا ويخدم نفس الوظيفة كما هو الحال في الثدييات2. ويتكون من ثلاثة فصوص، مع اثنين من الفصوص الظهرية وفص بطني واحد التي تتسطح على طول الأمعاء. وقد سبق إجراء استئصال الهيباتيك الجزئي في سمك الحمار الوحشي، مع روايات متضاربة حول الطريقة الدقيقة للتجديد. عادة، يتم إجراء استئصال الهيباتيك الجزئي ثلث عن طريق إزالة الفص البطني بأكمله. وأشارت التقارير الأولية إلى أنه بعد إزالة الفص البطني ، تم تجديده بالكامل في غضون أسبوع5،6،7، مما يشير إلى أنه على النقيض من كبد الثدييات ، فإن كبد الحمار الوحشي قادر على التجديد غير المتبلور. أظهرت الدراسات اللاحقة أن إزالة الفص البطني أدت إلى تجديد تعويضي في الفصوص الظهرية ، بدلا من تجديد الفص البطني المفقود ، وفي النهاية استعادة كتلة الكبد في غضون أسبوع8،9. كشف التنميط النسخي للفص الظهري بعد استئصال الفص البطني عن تغييرات كبيرة مرتبطة بالتجديد التعويضي10. وبالنظر إلى أن طريقة تجديد الكبد يمكن أن تختلف مع مدىالإصابة 8، تكهننا بأن التناقضات في النتائج قد تكون بسبب الاختلاف التقني في بروتوكول استئصال الكبد الجزئي بين مجموعات البحث.
يصف هذا البروتوكول إجراء لإجراء استئصال الهيباتيك الجزئي ثلث على حمار وحشي الكبار عن طريق إزالة الفص البطني. وستكون هذه التقنية قيمة لتقييم آليات تجديد الكبد.
Protocol
Representative Results
Discussion
الاختلافات التشريحية بين سمك الحمار الوحشي ونماذج الثدييات لتجديد الكبد تمثل تحديات فريدة من نوعها لاستئصال الكبد. الكبد في حمار وحشي على مقربة من القلب والأمعاء. عن غير قصد إتلاف أي من الأعضاء يؤدي إلى زيادة معدل الوفيات. لا يتم تغليف كبد حمار وحشي ، مما يجعل من الصعب فصله عن الأمعاء. الكب…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
أنا.M.O. معتمد من قبل NIAAA (F32AA027135). W.G. مدعوم من قبل R01DK090311، R01DK105198، R24OD017870، وبرنامج كلوديا آدامز بار للتميز في أبحاث السرطان. دبليو جي هو باحث بيو في العلوم الطبية الحيوية.
Materials
| 16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15700 | |
| 50 mL Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile | Corning | 352098 | |
| AS 82/220.R2 PLUS Analytical Balance | Bay State Scale & Systems, INC. | WL-104-1051 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| EMS Kuehne Coverglass/Specimen Forceps | Electron Microscopy Sciences | 72997-07 | |
| Epifluorescence microscope | Zeiss | Discovery.V8 | |
| Mastertop Cellulose Cleaning Scrub Sponge | Amazon | B07CBSM53Z | |
| PBS10X Liquid Conc 4L | EMD Millipore | 6505-4L | |
| Super Fine Micro Scissors, 3 1/4" straight | Biomedical Research Instruments | 11-1020 | |
| Tricaine methanesulfonate | Syndel | TRIC-M-GR-0010 | |
| Tween 20, Fisher BioReagents | Fischer Scientific | BP337-500 |
References
- Michalopoulos, G. K. Principles of liver regeneration and growth homeostasis. Comprehensive Physiology. 3, 485-513 (2013).
- Wang, S., Miller, S. R., Ober, E. A., Sadler, K. C. Making it new again: insight into liver development, regeneration, and disease from zebrafish research. Current Topics in Developmental Biology. 124, (2017).
- Michalopoulos, G. K., Bhushan, B. Liver regeneration: biological and pathological mechanisms and implications. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. , (2020).
- Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends in Genetics. 29, 611-620 (2013).
- Sadler, K. C., Krahn, K. N., Gaur, N. A., Ukomadu, C. Liver growth in the embryo and during liver regeneration in zebrafish requires the cell cycle regulator uhrf1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 1570-1575 (2007).
- Goessling, W., et al. APC mutant zebrafish uncover a changing temporal requirement for wnt signaling in liver development. Developmental Biology. 320, 161-174 (2008).
- Dovey, M., et al. Topoisomerase II is required for embryonic development and liver regeneration in zebrafish. Molecular and Cellular Biology. 29, 3746-3753 (2009).
- Kan, N. G., Junghans, D., Belmonte, J. C. I. Compensatory growth mechanisms regulated by BMP and FGF signaling mediate liver regeneration in zebrafish after partial hepatectomy. The FASEB Journal. 23, 3516-3525 (2009).
- Zhu, Z., Chen, J., Xiong, J. W., Peng, J. Haploinsufficiency of Def activates p53-dependent TGFβ signalling and causes scar formation after partial hepatectomy. PLoS One. 9, (2014).
- Feng, G., Long, Y., Peng, J., Li, Q., Cui, Z. Transcriptomic characterization of the dorsal lobes after hepatectomy of the ventral lobe in zebrafish. BMC Genomics. 16, 979 (2015).
- Michalopoulos, G. K. Liver regeneration. Journal of Cellular Physiology. 213, 286-300 (2007).
- Grisham, J. W. Organizational principles of the liver. The Liver: Biology and Pathobiology: Fifth Edition. , 1-15 (2009).
