Summary
本协议描述了在成年斑马鱼中去除肝脏腹叶以促进肝脏再生研究的程序。
Abstract
肝衰竭是全世界主要死因之一，美国慢性肝病死亡率急剧上升。健康的肝脏能够从有毒损伤中再生，但在晚期肝病中，肝脏的自然再生能力受到损害。斑马鱼已成为研究再生的强大实验系统。它们是研究部分肝切除术肝脏再生的理想模型，该手术具有直接的临床相关性，其中部分肝脏被手术切除，其余部分完好无损。没有部分肝切除术的标准方案;以前使用此模型的研究使用略有不同的协议，并报告了不同的结果。这里描述的是一个高效，可重复的协议，在成年斑马鱼进行部分肝切除术。我们使用这项技术来证明斑马鱼能够对被切除的叶进行表观再生。此协议可用于进一步询问斑马鱼肝脏再生所需的机制。
Introduction
在人类的实体器官中，肝脏是唯一能够再生的器官。这一点至关重要，因为肝脏是一个必不可少的器官，负责关键的代谢功能，能量储存，血液排毒，血浆蛋白的分泌，和胆汁生产2。因毒性或炎症性损伤而损失的肝细胞主要通过分割剩余的肝细胞1来取代。研究肝脏再生的一个经典实验模型是部分肝切除术，其中肝脏的个别叶被切除，留下剩余叶完好无损的3。这个过程最初是在大鼠体内开发的，其中大约三分之二的肝脏质量被切除。在哺乳动物进行部分肝切除术后，在剩余叶中发生补偿性再生，直到肝脏恢复其初始质量。值得注意的是，哺乳动物肝脏不能取代缺失的叶。
斑马鱼（达尼奥雷里奥）代表一个可驾可兰其法的模型，研究成人器官再生4。斑马鱼肝脏虽然在结构上不同于哺乳动物肝脏，但由相同的细胞类型组成，其功能与哺乳动物相同。它由三个叶组成，两个圆叶和一个沿着肠道扁平的单个腹叶。部分肝切除术以前在斑马鱼中进行过，关于精确再生模式的说法相互矛盾。通常，三分之一的部分肝切除术通过切除整个腹腔叶来执行。初步报告显示，在切除腹腔叶后，它在一周内完全再生5，6，7，这表明与哺乳动物肝脏相比，斑马鱼肝具有表观再生的能力。随后的研究表明，切除腹腔叶可导致主叶的补偿性再生，而不是缺失的腹叶的再生，并最终在8、9周内恢复肝脏质量。剖腹腔叶后对主叶的转录剖析显示与补偿性再生10相关的显著变化。鉴于肝脏再生模式可能随损伤程度而变化，我们推测结果的差异可能是由于研究组之间部分肝切除方案的技术差异。
本协议描述了通过切除腹腔叶对成年斑马鱼进行三分之一部分肝切除手术的程序。这项技术对于评估肝脏再生机制将很有价值。
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Protocol
斑马鱼是按照标准程序饲养和繁殖的。实验获得布里格姆和妇女医院机构动物护理和使用委员会（2016N000405）的批准。成年斑马鱼在协议开始前被禁食24小时。系统水是指水生设施中斑马鱼壳箱中的水。
1. 准备和麻醉
- 在系统水中准备 0.016% 三卡因溶液。
警告：如果三卡因与眼睛、皮肤或呼吸道接触，则是刺激物。 - 准备一块海绵，在解剖过程中举行麻醉斑马鱼。把一块满满的海绵切成四分之一。使用剃须刀刀片，去除与海绵区长轴平行的薄海绵楔子。
- 缝隙应该足够长，以适应成年鱼（这将不同大小的鱼）。例如，对于长度为 35 mm 的成年鱼，缝隙的长度应为 20 mm。头部和身体紧贴在海绵中，但尾巴穿过海绵的边缘（图1B）。
- 将海绵浸泡在 0.016% 三卡因溶液中。
- 将成年斑马鱼（雄性或雌性）放在 625 mL 的 0.016% 三卡因溶液中。
- 孵育6分钟或直到鱼没有反应触摸。
- 使用钳子，小心地将鱼从Tricaine水箱中取出，并将鱼腹侧放在海绵的凹槽中（图1A-B）。
- 将海绵置于自上而下照明的解剖显微镜下。
2. 手术
- 使用细钳，捏皮肤和鳞片内，只是后心（图1B）。
- 使用弹簧加载的剪刀，在钳子下切割，在机身腔内创建一个孔（图1C - D）。小心不要伤害心脏或主要血管，因为这将导致死亡率增加。
- 使用弹簧式剪刀，沿着腹部切口3-4毫米，在切口到达骨盆鳍（图1D-E）之前进行后部处理。此时，肝脏的腹叶可以通过切口可见。
- 用一只手挤压海绵的两侧，迫使内脏器官从体腔中取出。肝脏的腹叶在肠道顶部可见（图1F，2A-B）。肝脏将呈现为粉红色或橙色结构，分布在金棕色的肠道上。指定为虚假控制装置的动物此时已恢复。
- 挤压细钳，使两个锡接触。在保持海绵压力的同时，将细钳的锡滑入肝脏和肠道之间（图1G）。小心不要刺穿肠道，因为这会导致死亡率增加。
- 慢慢放松钳子上的压力，使钳子彼此移开（图1H）。这种滑动动作分离了心室叶和肠道之间的众多入口静脉附件（图2B），并且是清洁切除腹腔叶所必需的。重复此过程，直到肝脏和肠道之间的所有入口连接被切断。
- 用细钳将腹叶从肠道中剥下来，将腹叶从肝脏的其他部位切开（图1I）。
- 此程序导致三分之一的部分肝切除术（图1J）。
3. 恢复
- 小心地将鱼从海绵中取出，放入系统水箱中。
- 派佩特系统水在刺上几分钟，直到鱼自己游泳（图1K）。
- 监测鱼2-4小时，然后再将其放回系统。手术后整整24小时不要喂鱼。
- 在实验期间每天监测鱼。
- 随着时间的推移，身体壁的切口将自然愈合，而无需缝合（图1L，2C）。
4. 肠叶到肠长度分析
- 安乐死所有动物在冰水中分析10分钟，直到所有手术停止。
- 将鱼从冰水中取出，放在海绵槽的腹侧。
- 使用弹簧式剪刀，在心脏前后部位置的腹壁上切口。然后再做两个切口，沿着前后轴运行，从第一个切口一直到骨盆鳍。（图2A）。
- 剥去皮肤和肌肉，露出内脏器官（图2A）。
- 使用表观显微镜获取内脏器官的亮场和荧光图像。此视图范围将包括切除腹叶的区域。由于动物在分析前被安乐死，这种分析排除了对同一条鱼的长期成像。
5. 肝脏与体重比分析
- 安乐死所有动物在冰水中分析10分钟，直到所有手术停止。
- 将鱼放到 50 mL 圆锥管中。
- 在 1x PBS 中加入 25 mL 的 4% 副甲醛，在管中加入 0.3% 的 Tween。
警告：甲醛是有毒的，含有甲醛的溶液应始终在化学罩中处理。 - 在 4 °C 下营养 48 小时。
- 在 1x PBS 和 0.3% Tween 中执行 4 次 10 分钟洗涤。
- 用钳子取回鱼，在纸巾上擦干污渍。
- 记录整条鱼的重量。
- 使用弹簧式剪刀，在心脏前后部位置的腹壁上切口。然后，再做两个切口，沿着前后轴运行，从第一个切口一直运行到骨盆鳍。（图2A）。
- 剥去皮肤和肌肉，露出内脏器官（图2A）。
- 使用表观显微镜获取肝脏的亮场图像。
- 解剖肝脏，将肝脏碎片放在称重船上。
- 记录肝脏的重量。
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Representative Results
为了检查成年斑马鱼肝脏的再生潜力，我们在成年斑马鱼中进行了部分肝切除术（PHX）。一般来说，选择大成人（长度为30-40毫米），年龄从1.5-2.5岁不等。在单个实验中，动物是从同一个水箱中挑选出来的，年龄和大小都与动物相吻合。作为适当的控制，我们利用假手术，其中动物既麻醉，并接受了一个大切口在腹腔体壁，但恢复没有删除任何组织。假对照鱼的存活率从90%-100%不等，雄性斑马鱼和雌性斑马鱼的存活率都在90%-100%之间。PHX动物的存活率从雄性斑马鱼的60%-75%到雌性斑马鱼的60%-90%不等，所有死亡都发生在手术后的前24小时。
在PHX之后量化肝脏恢复的黄金标准是肝脏与体重比率，或LBR。这种检测已经用于测量哺乳动物11和斑马鱼模型8的肝脏质量恢复。为了可靠地量化肝脏的重量，我们对固定动物进行了体重测量，如前所述。我们对野生类型、未受伤的斑马鱼进行了LBR测量，发现与先前报告的8种一样，雌斑马鱼的LBR几乎是雄性斑马鱼的两倍（雌斑马鱼为3.3%，雄性斑马鱼为1.8%）（图3A）。我们在两性成年斑马鱼身上都进行了假象和PHX，并在受伤后0天和7天（图3B）分析了LBR。在0 dpi，假动物有一个清晰可见的腹腔叶，而在PHX动物的腹腔叶是完全不存在的（图3C）。值得注意的是，这导致LBR显著减少（雄鱼减少30%，雌鱼减少20%）（图3D）。在7分皮分析的鱼群中，我们发现腹叶没有再生（图3E），而PHX和假控的LBR是可比的（图3F）。这些测量表明，到7分，肝脏已经恢复质量相对于假控制，大概通过补偿再生在主骨叶，同意先前的报告8，9。
我们决定调查，给予足够的时间，肝脏的腹叶是否能够再生。成人Tg（fabp10a：CFP-NTR）鱼被选作实验，因为这些鱼在肝细胞中表达CFP，允许使用荧光显微镜可视化肝脏。一组动物接受了三分之一的局部肝切除术。动物分析在1或36分（图4A）。对于每只动物，测量了腹叶长度与肠道的比率（图4B）。
接受假手术的动物有一个突出的腹腔叶，占肠道长度的50%-100%，而接受三分之一部分肝切除术的动物的腹腔叶严重减少。引人注目的是，许多部分肝切除动物在36分皮有增加的腹腔叶与肠道的比例相比，部分肝切除动物在1分（图4C）。在假对照组中，腹叶的大小没有增加;然而，在部分肝切除术（图4D）恢复后，心室叶的大小在统计学上显著增加。我们注意到，对手术的反应有很大差异，有些动物没有再生，有些动物显然再生了定义明确的腹腔叶（图4E）。这些结果表明，腹叶能够从成年斑马鱼的手术肝脏剖析再生。综合起来，我们的工作表明斑马鱼肝脏能够同时表观和补偿性再生。
图1：成年斑马鱼的部分肝切除方案（A）图，注明前后轴和背切轴。（B） 麻醉后，动物被嵌入海绵（蓝色显示），使其处于腹腔一侧。细钳是用来捏皮肤只是后心脏。海绵不显示在随后的面板中以示清晰。（C） 剪刀是用来打破皮肤只是后心脏。（D-E）剪刀用于现在打开的伤口，使一个3-4毫米的切口运行从前体到后，终止之前的骨盆鳍。（F） 挤压海绵两侧会导致内脏器官从较大的伤口中弹出。（G） 两个叮当接触的细钳在肝脏和肠道的腹叶之间滑动。（H） 钳子是放松的，导致它们打破肝脏和肠道之间的入口静脉附着。这个过程沿着腹腔叶的长度重复。（I-J）腹叶从后端拉起，而剪刀用于切断肝脏其他部位的腹叶。（K） 动物被放置在一个有系统水的回收室中，在那里它恢复意识和权利本身。（L） 随着时间的过去，内脏被拉回体腔，伤口愈合。请单击此处查看此图的较大版本。
图2：斑马鱼解剖和部分肝切除术的恢复。（A）用于分析内脏器官，动物被安乐死，并将腹腔侧放在海绵上。首先，在心脏的前后位置（红线）进行切口。然后，生成两个切口，沿着前后轴运行到骨盆鳍（蓝线）。然后，皮肤和肌肉被剥回，露出内脏器官。标记是肝脏的肠道、腹腔叶和该叶的中央静脉。（B） 准备分析内脏器官的斑马鱼的腹视图的实时图像。肝脏的腹叶用一条虚线勾勒。2 倍图像中的黄色框表示 8 倍图像的位置。白色箭头表示肠道和肝脏之间的入口静脉连接。（C） 在指明的时间点对部分肝切除手术产生的伤口的文特尔视图。随着时间的推移，切口完全愈合。秤杆，500μm。请单击此处查看此图的较大版本。
图3：部分肝切除术后的补偿性再生。（A） 肝脏与体重（LBR）比率为野生类型、未受伤的斑马鱼。雌性斑马鱼的LBR几乎是雄性斑马鱼的两倍。雌性动物与雄性动物使用威尔科克森排名总和测试进行比较，****p <0.0001。（B） 示意图表明野生型斑马鱼用于此实验。动物接受假切除术或部分肝切除术（PHX），然后在受伤后0天或7天（dpi）固定。固定动物被成像并接受 LBR 测量。（C，E）显示的是动物在 0 dpi（C）和 7 dpi（E）处遭受虚假或 PHX 的代表性图像。注意 PHX 动物中完全没有腹叶。对于所有图像，显示的是内脏器官的腹腔视图。图像是明亮的磁场图像。肝脏的腹叶以白色勾勒。秤杆，500μm。（D，F）在假象和PHX手术后，雄斑马鱼和雌斑马鱼的肝脏与体重比率的条形图为0分（D）和7分（F）。柱子的高度是平均值，误差条表示SEM。虽然部分肝切除术后LBR在0分皮下有所减少，但PHX和假动物在7分皮下没有显著差异，表明LBR的恢复。部分肝切除样本被比较为使用威尔科森排名总和测试的假对照组， ns = 不显著， *p < 0.05， **p < 0.01。请单击此处查看此图的较大版本。
图4：斑马鱼在部分肝切除术后可以再生腹叶。 （A） 示意图表明 Tg（fabp10a：CFP-NTR） 用于此实验。手术和成像分析是在指示的时间点进行的。（B） 演示动物分析的示例图像。动物通过测量心室叶（红色）、肠道长度（黄色）和计算腹腔叶（白色）所占据的肠道百分比来量化。（C） 显示的是受伤后 1 天和 36 天内接受假切除术或部分肝切除术 （PHX） 的动物的代表性图像 （dpi）。（D） 紫罗兰图的腹腔叶长度与肠道长度的比例，动物接受假或部分肝切除术在1和36分皮。每个点代表单条鱼的价值。雄鱼的值是蓝色的，雌鱼是红色的。部分肝切除术样本被比较为使用威尔科森排名总和测试的虚假对照组， ns = 不显著， *p < 0.05 。（E） 显示的是两个部分肝切除动物在36分皮没有再生的例子，和两个实例，确实再生。对于所有图像，显示的是内脏器官的腹腔视图。图像是 CFP 荧光图像和亮场图像的合并。CFP荧光只存在于肝脏中。肝脏的腹叶以红色勾勒。腹叶占据的肠子百分比为白色。秤杆，500μm。请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
斑马鱼和哺乳动物肝脏再生模型之间的解剖学差异对肝脏切除提出了独特的挑战。斑马鱼的肝脏靠近心脏和肠道：无意中损坏任一器官会导致死亡率增加。斑马鱼肝脏没有封装，因此很难与肠道分离。肝脏通过入口静脉从肠道接收富含营养的血液。在哺乳动物中，离开肠道的静脉聚集在原位入口静脉上，然后在进入肝脏12时分裂。相比之下，斑马鱼肝脏从一系列从肠道直接进入肝脏的小血管接收入口循环（图2B）。因此，肝脏的每一个叶，在肠道上被夷为平地，被这些血管牢牢地连接到肠道上。尝试在不首先切断入口静脉的情况下切除腹腔叶通常会导致不完整的切除（数据未显示）。一些最初的协议描述拉出腹腔叶通过一个相对较小的切口，这不允许切断这些门户附件5，6。
此处描述的协议旨在解决这些挑战，以便实现一致的腹腔切除。麻醉斑马鱼被紧贴地放置在海绵的凹槽中，以保持它们的刺湿，它们的身体在手术过程中不动。将皮肤紧贴在心脏的后部，就可以在皮肤上放置切口，而不会损害任何内部器官。打开一个大（3-4毫米）切口使肝脏切除和评估切除程度简单（图2C）。重要的是，斑马鱼可以恢复并最终治愈这种大小的伤口，没有任何主要伤口关闭。通过挤压海绵和压缩身体壁，内脏器官变得更加容易接近，并有可能在肝脏和肠道之间滑动钳子的锡。然后，钳子可以用来切断肝脏和肠道之间的入口连接。一旦实现这一点，精细钳子可用于剥离腹腔叶，以便它可以从肝脏的其余部分分离。
我们测量了接受假手术和PHX手术的动物的肝脏与体重比率（LBR）。我们发现，到7分，PHX动物的LBR是可比的控制（图3F）。鉴于腹腔叶此时尚未再生（图3E），我们推断再生是通过对腹叶的补偿而发生的。为了解决腹腔叶最终能否在斑马鱼中再生的问题，我们进行了PHX检查，并检查了肝脏的再生。平均而言，腹叶与肠道的长度比1分贝高36分皮，表示腹叶再生（图4C-D）。动物对伤害的反应差异很大，有些动物的生长很少，而另一些动物的腹叶则恢复得相当可观（图4E）。我们的结论是，肝脏可以通过腹腔叶的表观再生和主叶的补偿性再生的混合物再生，尽管时间尺度不同。由于先前的研究已经使用部分肝切除术来检测单个基因5、7、9和切除后信号通路6、8、10的作用，我们预计这个协议将促进我们对成人脊椎动物肝脏再生的分子和细胞机制的理解。
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Disclosures
作者宣称他们没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
I.M.O. 得到国家海洋和.M协会 （F32AA027135） 的支持。W.G. 得到 R01DK090311、R01DK105198、R24OD017870 和克劳迪娅·亚当斯·巴尔癌症研究卓越计划的支持。W.G.是皮尤生物医学科学学者。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15700 | |
| 50 mL Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile | Corning | 352098 | |
| AS 82/220.R2 PLUS Analytical Balance | Bay State Scale & Systems, INC. | WL-104-1051 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| EMS Kuehne Coverglass/Specimen Forceps | Electron Microscopy Sciences | 72997-07 | |
| Epifluorescence microscope | Zeiss | Discovery.V8 | |
| Mastertop Cellulose Cleaning Scrub Sponge | Amazon | B07CBSM53Z | |
| PBS10X Liquid Conc 4L | EMD Millipore | 6505-4L | |
| Super Fine Micro Scissors, 3 1/4" straight | Biomedical Research Instruments | 11-1020 | |
| Tricaine methanesulfonate | Syndel | TRIC-M-GR-0010 | |
| Tween 20, Fisher BioReagents | Fischer Scientific | BP337-500 |
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