Partiell hepatektomi hos vuxna zebrafiskar

Summary

Detta protokoll beskriver förfarandet för att ta bort ventrala lob i levern i vuxna zebrafisk för att möjliggöra studier av lever regenerering.

Abstract

Leversvikt är en av de främsta dödsorsakerna i världen, och dödligheten från kronisk leversjukdom ökar kraftigt i USA. Friska lever kan regenerera från toxiska skador, men vid avancerad leversjukdom försämras leverns naturliga förmåga att regenerera. Zebrafisk har dykt upp som ett kraftfullt experimentellt system för att studera regenerering. De är en idealisk modell för att studera leverregenerering från partiell hepatektomi, ett förfarande med direkt klinisk relevans där en del av levern avlägsnas kirurgiskt, vilket lämnar resten intakt. det finns inget standardprotokoll för partiell hepatectomy; tidigare studier med denna modell har använt något olika protokoll och rapporterat olika resultat. Beskrivs här är ett effektivt, reproducerbart protokoll för att utföra en partiell hepatectomy i vuxna zebrafisk. Vi använder denna teknik för att visa att zebrafisk kan epimorfa regenerering av den resected lob. Detta protokoll kan användas för att ytterligare förhöra de mekanismer som krävs för leverregenerering hos zebrafisk.

Introduction

Bland de fasta organen hos människor är levern det enda organet som kan regenerering¹. Detta är kritiskt, eftersom levern är ett viktigt organ, ansvarigt för viktiga metaboliska funktioner, energilagring, blod avgiftning, utsöndring av plasmaproteiner och gallproduktion². Hepatocyter som förlorats på grund av toxiska eller inflammatoriska skador ersätts främst via delning av de återstående hepatocyterna¹. En klassisk experimentell modell för att studera leverregenerering är partiell hepatektomi, där enskilda lober i levern avlägsnas, vilket lämnar de återstående loberna^{intakta 3}. Detta förfarande utvecklades ursprungligen hos råttor, där ungefär två tredjedelar av levermassan avlägsnas. Efter partiell hepatektomi hos däggdjur sker kompensatorisk regenerering i de återstående loberna tills levern återhämtar sin ursprungliga massa. Särskilt ersätter däggdjurslever inte de saknade loberna.

Zebrafisk (Danio rerio) representerar en dragbar modell för studier av vuxen organregenerering⁴. Zebrafisklever, även om den strukturellt skiljer sig från däggdjurslever, består av samma celltyper och tjänar samma funktion som hos däggdjur². Den består av tre lober, med två dorsala lober och en enda ventral lob som plattas ut längs tarmarna. Partiell hepatectomy har tidigare utförts i zebrafisk, med motstridiga konton om det exakta läget för regenerering. Vanligtvis utförs en tredjedel partiell hepatectomy genom avlägsnande av hela ventrala caudaben. De första rapporterna visade att efter avlägsnandet av ventralloben regenererades den helt inom en vecka^5,6,7, vilket tyder på att zebrafisklever i motsats till däggdjurslever kan epimorfa regenerering. Efterföljande studier visade att avlägsnande av ventrala caudaben resulterade i kompensatorisk regenerering i dorsala lober, snarare än regenerering av den saknade ventrala lob, och slutligen återhämtning av levermassa inom en vecka^8,9. Transkriptomisk profilering av dorsala lober efter samband av ventrala caudaben visade betydande förändringar i samband med kompensatoriska regenerering¹⁰. Med tanke på att leverregenereringssättet kan variera med skadans omfattning⁸, spekulerade vi att skillnaderna i resultat kan bero på teknisk variation i det partiella hepatektomiprotokollet mellan forskargrupper.

Detta protokoll beskriver en procedur för att utföra en tredjedel partiell hepatectomy på vuxna zebrafish genom att ta bort ventrala caudaben. Denna teknik kommer att vara värdefull för att bedöma mekanismer för leverregenerering.

Protocol

Zebrafisk höjdes och uppföddes enligt standardprocedurer. Experimenten godkändes av Brigham and Women’s Hospital’s Institutional Animal Care and Use Committee (2016N000405). Vuxna zebrafiskar fastades i 24 h innan protokollet började. Systemvatten avser vattnet i zebrafiskhustankar i vattenanläggningen. 1. Förberedelse och bedövning Förbered 0,016% Tricaine-lösning i systemvatten.VARNING: Tricaine är irriterande om det kommer i kontakt med ögon, hud eller andningsorgan…

Representative Results

För att undersöka den regenerativa potentialen hos den vuxna zebrafisklever utförde vi partiell hepatektomi (PHX) hos vuxna zebrafiskar. I allmänhet valdes stora vuxna (30-40 mm i längd) från 1,5-2,5 år. Inom enskilda experiment valdes djur från samma tank och var ålders- och storleksmatchade. Som en lämplig kontroll använde vi falska operationer där djuret både bedövades och fick ett stort snitt i ventral kroppsväggen men återhämtades utan att ta bort någon vävnad. Överlevnaden för falska kontroller…

Discussion

De anatomiska skillnaderna mellan zebrafisk och däggdjursmodeller för leverregenerering utgör unika utmaningar för leverresektion. Levern i zebrafisk är i närheten av hjärtat och tarmarna; oavsiktligt skada något av organen resulterar i ökad dödlighet. Zebrafisklever är inte inkapslad, vilket gör det svårare att separera från tarmarna. Levern får näringsrikt blod från tarmarna genom portalvener. Hos däggdjur konvergerar vener som lämnar tarmarna på en primär portalven som sedan delas när den kommer …

Materials

16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM Grade	Electron Microscopy Sciences	15700
50 mL Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile	Corning	352098
AS 82/220.R2 PLUS Analytical Balance	Bay State Scale & Systems, INC.	WL-104-1051
Dumont #55 Forceps	Fine Science Tools	11295-51
EMS Kuehne Coverglass/Specimen Forceps	Electron Microscopy Sciences	72997-07
Epifluorescence microscope	Zeiss	Discovery.V8
Mastertop Cellulose Cleaning Scrub Sponge	Amazon	B07CBSM53Z
PBS10X Liquid Conc 4L	EMD Millipore	6505-4L
Super Fine Micro Scissors, 3 1/4" straight	Biomedical Research Instruments	11-1020
Tricaine methanesulfonate	Syndel	TRIC-M-GR-0010
Tween 20, Fisher BioReagents	Fischer Scientific	BP337-500