כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצירת מודל עור תלת מימדי פשוט ובלתי מופרע באמצעות פלטפורמה מיקרופלואידית מיקרו-מכונות. גישת זרימה מקבילה מאפשרת תצהיר במקום של תא עורי לזרוע של תאי אפיתל על גבי, כל נשלט על ידי משאבות מזרק.
עבודה זו מציגה פלטפורמה מיקרופלואידית חדשה, חסכונית ואמינה עם פוטנציאל ליצור רקמות מרובות שכבות מורכבות. כהוכחה לרעיון, עור אנושי פשוט ובלתי מובחן המכיל תא עורי (סטרומי) ותא אפיתל (אפיתל). לשם כך פותח מכשיר רב-תכליתי וחזק המבוסס על ויניל המחולק לשני תאים, המתגבר על חלק מהחסרונות הקיימים במכשירים מיקרופלואידיים המבוססים על פולידימתילסילוקסן (PDMS) ליישומים ביו-רפואיים, כגון שימוש בציוד יקר ומיוחל או ספיגת מולקולות וחלבונים קטנים והידרופוביים. יתר על כן, פותחה שיטה חדשה המבוססת על זרימה מקבילה, המאפשרת תצהיר במקום של תאי העור והאפידרמיס. מבנה העור מורכב מטריצת פיברין המכילה פיברובלסטים ראשוניים אנושיים ומונו-שכבתית של קרטינוציטים מונצחים המושרשת למעלה, אשר נשמרת לאחר מכן בתנאי תרבות דינמיים. פלטפורמה מיקרופלואידית חדשה זו פותחת את האפשרות לדגמן מחלות עור אנושיות ולהסיק את השיטה ליצירת רקמות מורכבות אחרות.
לאחרונה, חלה התקדמות לקראת פיתוח וייצור של מודלים מעור אנושי במבחנה לניתוח הרעילות של מוצרי קוסמטיקה ותרופות1. חוקרים בתעשיות התרופות וטיפוח העור משתמשים בבעלי חיים, עכברים הם הנפוצים ביותר, כדי לבדוק את המוצרים שלהם2,3,4,5. עם זאת, בדיקת מוצרים על בעלי חיים אינה תמיד מנבאת את התגובה בבני אדם, אשר מוביל לעתים קרובות לכשל תרופתי או תופעות לוואי בבני אדם וכתוצאה מכך להפסדים כלכליים5,6. בריטניה הייתה המדינה הראשונה שאסרה על שימוש בבעלי חיים לבדיקות קוסמטיות בשנת 1998. מאוחר יותר, בשנת 2013, האיחוד האירופי אסר על בדיקה והרחקה של מוצרי קוסמטיקה בבעלי חיים (תקנה קוסמטיקה של האיחוד האירופי מס ‘1223/2009)7.
איסור זה נשקלת גם על ידי מדינות אחרות כגון “חוק הקוסמטיקה ההומנית” בארה”ב8. בנוסף לחששות אתיים, ההבדלים האנטומיים בין עור בעלי חיים לבני אדם הופכים את הניסויים בבעלי חיים לגוזלי זמן רב, יקרים ולעתים קרובות לא יעילים. יתר על כן, גודל השוק העולמי לבדיקות רעלים במבחנה צפוי להגיע ל -26.98 מיליארד דולר עד 20259. מסיבות אלה, יש צורך לפתח שיטות וחלופות חדשות עבור אלה במחקרי מבחנה, כגון מודלים של עור אנושי ביו-הנדסה, המאפשרים בדיקות לבטיחות והשפעות רעילות של קוסמטיקה ותרופות ללא שימוש בבעלי חיים.
ישנם שני סוגים שונים של מודלים מסחריים זמינים, במבחנה, עור אנושי. הסוג הראשון מורכב משכבות אפידרמיס המקבילות שכבות מרובות של קרטינוציטים הבחנה כי הם זרעים על חומרים שונים. חלקם אושרו על ידי הארגון לשיתוף פעולה ופיתוח כלכלי (OECD) ואומתו על ידי (המרכז האירופי לאימות שיטות חלופיות (ECVAM) לבדיקות קורוזיה וגירוי בעור, כגון EpiDerm או SkinEthic10,11,12. הסוג השני הוא שווה ערך לעור מלא עם שכבה של קרטינוציטים אנושיים מובחנים המושרשים על פיגום תלת מימדי (3D) המכיל פיברובלסטים, כגון T-Skin ו- EpiDerm-FT. עם זאת, מודלים אלה הם תרבותיים בתנאים סטטיים, מה שהופך אותם לא מסוגל לייצג במדויק תנאים פיזיולוגיים אנושיים.
העניין האחרון התמקד ביצירת מודלים של עור במבחנה תלת-ממדית בפורמטים של הוספת תרבית תאים (CCI) עם זלוף דינמי13,14,15,16,17,18,19. עם זאת, מערכות אלה לא יכולות להיחשב קפדניות sensu כמו עור על שבבים microfluidic לפי ההגדרה הקלאסית שלהם בתחום. ההגדרה של אינגר לאיברים על שבב קובעת כי האיבר חייב להיות ממוקם בתוך הערוצים microfluidic, שהוא מצב כי רק כמה מכשירים למלא20,21. עור על שבבים יש עד כה מודל בעיקר אפיתליה פשוטה כמו שכבות תא יחיד ו / או שכבות תא עור מופרדות על ידי קרום נקבובי22,23. למרות שהיו כמה התקדמות מידול העור במערכות microfluidic16,24, אין כרגע ספרות המציגה מערכת איבר על שבב שמתאימה להגדרה של אינגר, מסוגל לייצר עור רב שכבתי במקום וכולל הן רכיבים אפיתל סטרומיים.
בעבודה זו מוצגת פלטפורמה מיקרופלואידית חדשה, חסכונית, חזקה ומבוססת ויניל עבור יישומי עור על שבב. פלטפורמה זו הופקה על ידי עיבוד מיקרו, המספק פשטות רבה יותר בתהליך הייצור, כמו גם גמישות מוגברת ורב-תכליתיות בפריסת המכשיר, תוך התגברות על חלק מהמגבלות של PDMS25. כמו כן תוכננה דרך להציג מבנה עור פשוט באמצעות זרימה מקבילה הנשלטת באמצעות משאבות מזרק. זרימה מקבילה מאפשרת שני נוזלים עם צמיגות שונה מאוד (חיץ ופיברין pre-gel במקרה זה) להיות perfused דרך ערוץ מבלי לערבב אחד עם השני. כהוכחה לרעיון, הוכנס למכשיר מבנה דרמו-אפידרמיס המכיל פיברובלסטים המוטבעים במטריצת פיברין המחקה את הדרמיס, ומעליו נטען מונולייר של קרטינוציטים כדי לחקות את האפידרמיס הגלי. ניתן לאפנן את גובה התא העורי על-ידי שינוי קצבי הזרימה. החידוש העיקרי של עבודה זו, בהשוואה לדגמים שתוארו בעבר22,26,27,28,29, הוא פיתוח של מבנה תלת מימדי בתוך microchamber באמצעות מיקרופלואידיקה. למרות מאמר זה מציג עור פשוט לא מובחן, המטרה לטווח ארוך היא ליצור ולאפיין מבנה עור מובחן לחלוטין כדי להדגים את הכדאיות שלה ואת הפונקציונליות למטרות בדיקה סמים וקוסמטיים.
המוטיבציה לפתח שיטה זו הייתה הרצון לדגמן מחלות עור וללמוד את ההשפעות של טיפולים חדשים וחדשניים בפלטפורמה בעלת תפוקה גבוהה. עד כה, מעבדה זו מייצרת את המקבילות הדרמו-אפידרמיס האלה על ידי יציקה – באופן ידני או בעזרת טכנולוגיית הביו-הדפסה התלת-ממדית – ג’ל הפיברין עם פיברובלסטים לתוך צלחת הכנסת …
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים מקרב לב לד”ר חוויאר רודריגז, ד”ר מריה לואיזה לופז, קרלוס מטלן וחואן פרנסיסקו רודריגז על הצעות מועילות מאוד, דיונים ו / או נתונים ראשוניים. אנו מודים בחביבות גם על תרומתם של סרג’יו פרננדז, פדרו הררוס ולארה סטולזנבורג לפרויקט זה. תודה מיוחדת ללכת ד”ר מרתה גרסיה עבור GFP-תווית hFBs ו hKCs. לבסוף, אנו מזהים את הסיוע הטכני המצוין של גיירמו ויזקאינו ואנג’ליקה קוראל. עבודה זו נתמכה על ידי “Programa de Actividades de I+D entre Grupos de Investigación de la Comunidad de Madrid”, Project S2018/BAA-4480, Biopieltec-CM. עבודה זו נתמכה גם על ידי “Programa de excelencia”, פרויקט EPUC3M03, CAM. CONSEJERÍA DE EDUCACIÓN E INVESTIGACIÓN.
Amchafibrin | Rottafarm | Tranexamic acid | |
Antibiotic/antimycotic | Thermo Scientific HyClone | ||
Calcium chloride | Sigma Aldrich | ||
Culture plates | Fisher | ||
DMEM | Invitrogen Life Technologies | ||
Double-sided tape vynil | ATP Adhesive Systems | GM 107CC, 12 µm thick | |
Edge plotter | Brother | Scanncut CM900 | |
FBS | Thermo Scientific HyClone | ||
Fibrinogen | Sigma Aldrich | Extracted from human plasma | |
Glass slide | Thermo Scientific | ||
GFP-Human dermal fibroblasts | – | Primary. Gift from Dr. Marta García | |
H2B-GFP-HaCaT cell line | ATCC | Immortalized keratinocytes. Gift from Dr. Marta García | |
Live/dead kit | Invitrogen | ||
PBS | Sigma Aldrich | ||
Polycarbonate membrane | Merk TM | 5 µm pore size | |
Polydimethylsiloxane | Dow Corning | Sylgard 184 | |
Sodium chloride | Sigma Aldrich | ||
Syringes | Terumo | 5 mL | |
Thrombin | Sigma Aldrich | 10 NIH/vial | |
Transparent adhesive vinyl | Mactac | JT 8500 CG-RT, 95 µm thick | |
Trypsin/EDTA | Sigma Aldrich | ||
Tubing | IDEX | Teflon, 1/16” OD, 0.020” ID |