펩타이드 매트릭스에 근거한 HLA-DR-제한 CD4 T 세포 에피토프의 HBV 특정 CD4 T 세포 반응 및 식별의 분석
Summary
B형 간염 바이러스(HBV)유래 펩타이드 매트릭스에 기초하여, HBV 특이적 CD4 T 세포 반응은 HBV 특이적 CD4 T 세포 에피토프의 식별과 병행하여 평가될 수 있었다.
Abstract
CD4 T 세포는 만성 B형 간염의 병인에 있는 중요한 역할을 합니다. 다목적 세포 집단으로서, CD4 T 세포는 분비한 사이토카인에 기초한 뚜렷한 기능성 하위 집합으로 분류되었습니다: 예를 들어, CD4 T 도우미 1 세포를 위한 IFN-γ, CD4 T 도우미 2 세포에 대한 IL-4 및 IL-13, CD4 T 여포 도우미 세포를 위한 IL-21 및 CD4 T 헬퍼 셀용 IL-17. HBV 유래 펩티드 자극 후 사이토카인 분비를 기반으로 한 B형 간염 바이러스(HBV)-특이적 CD4 T 세포의 분석은 HBV 특이적 CD4 T 세포 반응의 크기뿐만 아니라 HBV 특이적 CD4 T 세포의 기능적 서브세트에 대한 정보를 제공할 수 있었다. 전사학 및 메타볼로믹스 분석과 같은 새로운 접근법은 HBV 특이적 CD4 T 세포에 대한 보다 상세한 기능 정보를 제공할 수 있습니다. 이러한 접근법은 일반적으로 펩타이드-주요 조직적합성 복합-II 멀티머를 기반으로 실행 가능한 HBV 특이적 CD4 T 세포의 격리가 필요하며, 현재 HBV 특이적 CD4 T 세포 에피토프에 대한 정보는 제한적이다. HBV 유래 펩타이드 매트릭스를 기반으로, HBV 특이적 CD4 T 세포 반응을 평가하고 만성 HBV 감염 환자로부터 말초 혈액 단핵세포 샘플을 사용하여 HBV 특이적 CD4 T 세포 에피토프를 동시에 식별하는 방법이 개발되었다.
Introduction
현재 항원 특이적 T 세포를 분석하는 3가지 주요 접근법이 있다. 첫 번째 접근법은 T 세포 수용체와 펩타이드 (epitope)사이의 상호 작용에 기초한다. 항원 특이적 T 세포는 펩티드-주요 조직적합성 복합체(MHC) 다중머로 직접 염색될 수 있다. 이 방법의 장점은 다운스트림 전사학/메타볼로믹스 분석에 적합한 실행 가능한 항원 특이적 T 세포를 얻을 수 있다는 것입니다. 이 방법의 한계는 특정 항원에 대한 전체 T 세포 반응에 대한 정보를 제공할 수 없다는 것입니다, 특정 항원에 대한 확인된 에피토프의 수가 현재 제한되어 있는 동안 검증된 에피토프 펩티드가 필요하기 때문이다. B형 간염 바이러스(HBV)-특이적 CD8 T 세포 에피토프에 비해, HBV 특이적 CD4 T 세포 에피토프가1,2로확인되어현재 HBV 특이CD4 T 세포의 분석에 덜 적용할 수 있게 되었다.
두 번째 접근법은 항원 펩타이드 자극3후 일련의 활성화 유도 마커의 업레조절에 기초한다. 일반적으로 사용되는 마커는 CD69, CD25, OX40, CD40L, PD-L1, 4-1BB4를포함한다. 이 방법은 현재 예방접종대상자5,6,인간 면역결핍 바이러스 감염 환자7,중증 급성호흡기증후군 코로나바이러스 2감염환자8,9에서항원 특이적 T세포 반응을 분석하는 데 사용되어 왔다. 펩타이드-MHC 멀티머 기반 분석과 는 달리, 이 방법은 검증된 전형체에 의해 제한되지 않으며 다운스트림 분석을 위한 실행 가능한 세포를 얻을 수 있었다. 이 방법의 한계는 항원 특이적 T 세포의 사이토카인 프로파일에 대한 정보를 제공할 수 없다는 것이다. 또한, 일부 활성화된 항원 특이적 세포에 의한 이러한 활성화 유도 마커의 발현은 분석에서 배경 신호에 기여할 수 있으며, 이는 특히 표적 항원 특이적 T 세포가 드물 때 문제가 될 수 있다. 현재, HBV 특이CD4 T 셀4에대한 이 방법의 제한된 적용이 있다. 이 방법이 HBV 특이적 CD4 T 세포를 신뢰할 수 있는 방식으로 분석하기 위해 활용할 수 있는지 여부는 추가 조사가 필요합니다.
세 번째 접근법은 항원 펩타이드 자극 후 사이토카인 분비를 기반으로 한다. 활성화 유도 마커 기반 분석과 마찬가지로 이 방법은 검증된 전형에 의해 제한되지 않습니다. 이 방법은 항원 특이적 T 세포의 사이토카인 프로파일을 직접 밝힐 수 있었다. 이 방법의 감도는 항원 특이적 T 세포의 사이토카인 분비에 의존하기 때문에 활성화 유도 마커 기반 방법보다 낮으며 테스트된 사이토카인의 수는 일반적으로 제한적이다. 현재, 이 방법은 HBV 특이적 T 세포의 분석에 널리 사용된다. HBV 특이적 T 세포를 분비하는 사이토카인은 직접 전 생체 펩타이드자극(10,11)에의해 거의 검출될 수 없기 때문에, HBV 특이적 T 세포의 사이토카인 프로파일은 보통 10일 후에 시험관내 펩타이드 자극 팽창팽창,13,14,15,16을분석한다. 매트릭스 형태로 펩티드 풀의 배열은 항원 특이적에피토프(17,18)의식별을 용이하게 하기 위해 활용되고 있다. 펩타이드 매트릭스와 사이토카인 분비 분석의 조합으로 HBV 특이적 CD4 T 세포 반응을 평가하고 HBV 특이적 CD4 T 세포 에피토프를 동시에 식별하는 방법이개발되었다 16. 이 프로토콜에서는 이 메서드의 세부 정보가 설명되어 있습니다. HBV 코어 항원은 이 프로토콜에서 데모의 예로 선택된다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 다음과 같이 나열됩니다: 1) PBMC 확장을 시작할 가능성이 높은 충분한 PBMC; 2) PBMC 확장에 적합한 환경; 및 3) 에피토프 식별 전에 PBMC 배양에서 잔류 펩티드 풀을 완전히 제거합니다.
이 프로토콜의 모든 분석은 CD4 T 셀의 강력한 증식에 따라 달라집니다. 일반적으로 10일 확장 후 PBMC 수는 초기 수의 2~3배입니다. 세포 수와 PBMC의 생존 가능성은…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 중국 국립 자연과학 재단(81930061), 충칭자연과학재단(cstc2019jcyj-bshX0039, cstc2019jcyj-zdxxX0004), 중국키에 의해 지원되었습니다.
전염병 전문 프로젝트 (2018ZXX10723203).
Materials
| Albumin Bovine V (BSA) | Beyotime | ST023 | |
| APC-conjugated Anti-human TNF-α | eBioscience | 17-7349-82 | Keep protected from light |
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Limit cell clumping |
| B lymphoblastoid cell lines (BLCLs) | FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER | IHW09126 | HLA-DRB1*0803 homozygote |
| B lymphoblastoid cell lines (BLCLs) | FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER | IHW09121 | HLA-DRB1*1202 homozygote |
| Cell Culture Flask (T75) | Corning | 430641 | |
| Cell Culture Plate (96-well, flat bottom) | Corning | 3599 | Flat bottom |
| Cell Culture Plate (96-well, round bottom) | Corning | 3799 | Round bottom |
| Cell Strainer | Corning | CLS431751 | Pore size 70 μm, white, sterile |
| Centrifuge Tube (15 mL) | KIRGEN | KG2611 | Sterile |
| Centrifuge Tube (50 mL) | Corning | 430829 | Sterile |
| Centrifuge, Refrigerated | Eppendorf | 5804R | |
| Centrifuge, Refrigerated | Thermo | ST16R | |
| Centrifuge, Refrigerated | Thermo | Legend Micro 21R | |
| Cytofix/Cytoperm Kit (Transcription Factor Buffer Set) | BD Biosciences | 562574 | Prepare solution before use |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | Keep at room temperature to prevent crystallization |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Prepare ddH2O (1000 ml) containing NaCl (8000 mg), KCl (200 mg), KH2PO4 (200 mg), and Na2HPO4.7H2O (2160 mg). Adjust PH to 7.4. Sterilize through autoclave. | ||
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | 17-5442-03 | |
| Filter Tips (0.5-10) | Kirgen | KG5131 | Sterile |
| Filter Tips (100-1000) | Kirgen | KG5333 | Sterile |
| Filter Tips (1-200) | Kirgen | KG5233 | Sterile |
| FITC-conjugated Anti-human CD4 | BioLegend | 300506 | Keep protected from light |
| Fixable Viability Dye eFluor780 | eBioscience | 65-0865-14 | Keep protected from light |
| GolgiStop Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin) | BD Biosciences | 554724 | Protein Transport Inhibitor |
| Haemocytometer | Brand | 718620 | |
| HBV Core Antigen Derived Peptides | ChinaPeptides | ||
| HEPES | Gibco | 15630080 | 100 ml |
| Human Serum AB | Gemini Bio-Products | 100-51 | 100 ml |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I0634 | |
| KCl | Sangon Biotech | A100395-0500 | |
| KH2PO4 | Sangon Biotech | A100781-0500 | |
| LSRFortessa Flow Cytometer | BD | ||
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | 100 ml |
| Microcentrifuge Tube (1.5 mL) | Corning | MCT-150-C | Autoclaved sterilization before using |
| Microplate Shakers | Scientific Industries | MicroPlate Genie | |
| Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sangon Biotech | A100348-0500 | |
| NaCl | Sangon Biotech | A100241-0500 | |
| PCR Tubes (0.2 mL) | Kirgen | KG2331 | |
| PE/Cy7-conjugated Anti-human CD8 | BioLegend | 300914 | Keep protected from light |
| PE-conjugated Anti-human IFN-γ | eBioscience | 12-7319-42 | Keep protected from light |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 | 100 ml |
| PerCP-Cy5.5-conjugated Anti-human CD3 | eBioscience | 45-0037-42 | Keep protected from light |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Recombinant Human IL-2 | PeproTech | 200-02 | |
| Recombinant Human IL-7 | PeproTech | 200-07 | |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | C11875500BT | 500 ml |
| Sodium pyruvate,100mM | Gibco | 15360070 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Ultra-LEAF Purified Anti-human HLA-DR | BioLegend | 307648 | |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1125 |
References
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