収穫と分解:バイオフィルム法研究における見過ごされたステップ
Summary
この論文では、2つの表面タイプにおける3つの一般的なバイオフィルム収穫および分解技術、収穫方法の堅牢性試験、および再現性を高めるために収穫および分解技術を選択および最適化する際に考慮すべき最小限の情報を示す方法を詳述する。
Abstract
バイオフィルム法は、関連するモデルでバイオフィルムを成長させる、成熟したバイオフィルムを処理する、表面からバイオフィルムを採取し、凝集塊を分解する、およびサンプルを分析するという4つの異なるステップからなる。4つのステップのうち、収穫と分解は最も研究されていませんが、テストバイアスの可能性を考慮すると、それにもかかわらず重要です。この記事では、3つの異なる表面で成長したバイオフィルムに一般的に使用される収穫および分解技術を示します。広範な文献レビューから収集された3つのバイオフィルム収穫および分解技術には、ボルテックスおよび超音波処理、スクレイピングおよび均質化、ならびにスクレイピング、ボルテックスおよび超音波処理が含まれる。硬質非多孔質(ポリカーボネートおよびホウケイ酸ガラス)と多孔質(シリコーン)の2つの表面タイプが考慮される。さらに、従う収穫技術を報告する際に含めるべき最小限の情報と、バイアスをチェックするための付随する方法に関する推奨事項を提供します。
Introduction
バイオフィルムの定義は過去数十年にわたって進化しており、さまざまな生物学的および/または非生物学的表面との微生物の関連、マトリックス内の異なる成長および遺伝子発現2を示す非細胞成分1の包含を包含する。バイオフィルムは、乾燥などの環境ストレスからの保護を提供し、微生物の生存をもたらす化学消毒剤の作用をあまり効果的でないものにする可能性があります。バイオフィルム内の生存者は、公衆衛生上の懸念事項である病原性微生物の発生源を提供する可能性があります3。
バイオフィルム法は、成長、処理、サンプリング(収穫および分解)、および分析の4つのステップで構成されています。成長は、第1のステップにおいて、使用者が生物の生育条件、温度、媒体等を決定するところ、バイオフィルム文献4、5、6、7において最も考慮され、報告されている。処理ステップは、抗菌剤(例えば、消毒剤)を評価して、成熟バイオフィルム3、8、9に対するそれらの有効性を決定するか、または抗菌剤が表面に組み込まれ得るバイオフィルム増殖を防止または低減する製品の能力を決定する10。第3のステップは、サンプリング、それが成長していた表面からバイオフィルムを採取し、除去された凝集塊を分解するステップ3、8、11を含む。第4のステップは、分析、生細胞数、顕微鏡観察、蛍光測定、分子転帰、および/またはマトリックス成分評価8、9を含み得る。データの評価は、実験の結果に関する情報を提供します。4つのうち、サンプリングは、選択されたバイオフィルム収穫および/または分解技術が100%効果的であり、しばしば検証なしで行われると想定しているため、最も見過ごされがちなステップです11。
細菌のプランクトン懸濁液は、しばしば均質であると考えられ、分析の前に単純なボルテックスを必要とする。しかし、バイオフィルムは、微生物(原核生物および/または真核生物)、エキソ多糖類、タンパク質、脂質、細胞外DNA、および宿主細胞で構成される複雑なコミュニティです12。表面からバイオフィルムを適切に採取し、それを均質な単一細胞懸濁液に分解するためには、従来のプランクトン微生物学的培養方法を超えるステップが必要である。広範な文献レビュー(この刊行物には含まれていない情報)は、除去および脱凝集技術の選択が、バイオフィルム中に存在する種、バイオフィルムが付着している表面(非多孔質または多孔質)、成長表面への接近性(容易に除去可能なクーポンまたはバイオフィルムが成長している装置の物理的破壊)を含む多くの要因に依存することを実証した。 表面形状(面積および形状)、成長表面上のバイオフィルムの密度、および利用可能な実験装置。
バイオフィルムが表面から回収されると、得られる細胞懸濁液は異種である。この不均一な懸濁液を正確に列挙しようとする場合、個々の細胞に分解されなければならない。生存プレート数は、コロニー形成単位が1つの細菌に由来すると仮定する。バイオフィルムの凝集体が増殖培地上に置かれると、個々の細胞を区別することは不可能であり、不正確な推定につながる可能性がある。例えば、消毒剤有効性試験中に、処置が対照と比較して表面からバイオフィルムを非常に効果的に除去する場合、対数の減少は対照と比較して人為的に大きく見える可能性がある。一方、バイオフィルムを表面に固定する化学消毒剤は、対照と比較して、対数減少が低いように見えます11。このタイプのシナリオは、実験データの偏った解釈につながる可能性があります。
出版の準備として、文献のレビューは、バイオフィルムを収穫および分解するための一般的なアプローチが、掻き取り、スワビング、超音波処理、ボルテックスまたはこれらの組み合わせを含むと判断した。掻き取りは、滅菌スティック、ヘラまたは他のツールを用いて表面からバイオフィルムを物理的に除去することと定義される。スワビングとは、綿の先端のスティックまたは他の固定吸収材料を用いて表面からバイオフィルムを除去することを指す。超音波処理は、水を介して分布する超音波を介して表面からのバイオフィルムの破壊を指す。ボルテックスとは、チューブ内のサンプルの液体渦を達成するためのミキサーの使用を指します。均質化は、回転ブレードを使用して、回収されたバイオフィルム凝集塊を単一の細胞懸濁液に剪断する。本稿では、硬質/非多孔質と多孔質の2つの異なる表面タイプに対する3つの収穫および分解方法を提示する。
研究者が出版物の方法セクションに含めるべき推奨される最低限の情報のリストが提供されています。この情報を含めることで、他の研究者が自分の研究を再現できることを願っています。完璧な収穫および分解方法がないため、技術を確認する方法に関する推奨事項も提供されます。
この記事では、一般的な成長表面からバイオフィルムを収穫および分解する3つの一般的な方法が示されています。この情報により、研究者はバイオフィルム試験法の全体的な精度とバイアスをよりよく理解することができます。記載されている方法は次のとおりです:(1)CDCバイオフィルムリアクター内の高流体せん断下でポリカーボネートクーポン(硬質非多孔質表面)上に成長させた 緑膿菌 バイオフィルムを採取し、バイオフィルムの採取および解凝集を達成するためにボルテックスおよび超音波処理の5つのステップの組み合わせに続いて解凝集する(2)A P. 低流体せん断下でドリップフローリアクター内のホウケイ酸ガラスクーポン(硬質非多孔質表面)上に成長したバイオフィルムを回収し、掻き取りおよび均質化を用いて解凝集させる(3)シリコーンチューブ(多孔質表面)で成長させた 大腸菌 バイオフィルムを採取し、掻き取りを用いて解凝集させ、続いて超音波処理およびボルテックス処理を行う。
Protocol
Representative Results
Discussion
収穫および分解方法に関する最小情報
科学界全体で再現可能なバイオフィルムデータを作成するには、バイオフィルム法の成長、治療、サンプリング、分析の各ステップについて、著者ができるだけ多くの詳細を含めることが不可欠です。バイオフィルム法の標準化は、研究者が特定の方法および関連する修正を参照することを可能にするので、この努力を助けてきた。しか?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Danielle Orr Goveia、Blaine Fritz、Jennifer Summers、Fei San Leeが本論文に貢献したことに感謝したい。
Materials
| 50 mL conical vials | Thermo Scientific | 339652 | |
| 100 mL glass beakers | Fisher Scientific | FB102100 | |
| 5 mL serological pipettes | Fisher Scientific | 13-678-12D | For adding treatment to vials containing coupons. |
| 50 mL serological pipettes | Fisher Scientific | 13-678-14C | For adding neutralizer to vials at the end of treatment contact time. |
| Applicator sticks | Puritan | 807 | |
| Hemostats | Fisher Scientific | 16-100-115 | |
| Metal spatula | Fisher Scientific | 14-373 | |
| PTFE policemen | Saint-Gobain | 06369-04 | |
| S 10 N – 10 G – ST Dispersing tool | IKA | 4446700 | For homogenization of biofilm samples. |
| Scissors | Fisher Scientific | 08-951-20 | |
| Silicone Foley catheter, size 16 French | Medline Industries | DYND11502 | |
| Silicone tubing, size 16 | Cole-Parmer | EW96400-16 | |
| Splash Guards | BioSurface Technologies, Inc. | CBR 2232 | |
| T 10 basic ULTRA-TURRAX Disperser | IKA | 3737001 | For homogenization of biofilm samples. |
| Tubing connectors | Cole-Parmer | EW02023-86 | |
| Ultrasonic Cleaner | Elma | TI-H15 | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Vortex-Genie 2 Vertical 50 mL Tube Holder | Scientific Industries | SI-V506 |
References
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