收获与分散：被忽视的生物膜研究方法中的关键步骤

摘要

本文详细介绍了在两种表面类型上进行生物膜采集和分散的三种常用方法，采集方法的稳健性测试，以及在选择和优化采集与分散技术时需考虑的最低限度信息，以提高实验的可重复性。

摘要

生物膜实验方法包含四个明确的步骤：在相关模型中培养生物膜、处理成熟的生物膜、从表面收获生物膜并分散聚集体，以及分析样品。在这四个步骤中，收获与分散步骤的研究最少，但在考虑潜在测试偏差时却至关重要。本文展示了在三种不同表面上生长的生物膜常用的收获与分散技术。这三种生物膜收获与分散技术是通过广泛的文献综述获得的，包括涡旋振荡与超声处理、刮取与均质化处理，以及刮取后进行涡旋振荡和超声处理。所考虑的两种表面类型为：非多孔硬质表面（聚碳酸酯和硼硅酸盐玻璃）和多孔表面（硅胶）。此外，我们还提供了在报告所采用的收获技术时应包含的最低限度信息建议，以及一种用于检测偏差的配套方法。

引言

生物膜的定义在过去几十年中不断演变，现涵盖微生物与多种生物性和/或非生物表面的关联，以及包含非细胞成分¹的结构，其中微生物在基质内表现出不同的生长特性和基因表达²。生物膜可保护微生物免受干燥等环境压力的影响，并可能降低化学消毒剂的作用效果，从而导致微生物存活。生物膜内的存活微生物可能成为对公共卫生构成威胁的病原微生物来源³。

生物膜实验方法包括四个步骤：培养、处理、取样（收获与分散）以及分析。第一步培养是生物膜文献中最常被考虑和报道的步骤，用户在此阶段确定生物体的生长条件，如温度、培养基等^4,5,6,7。第二步处理用于评估抗菌剂（例如消毒剂）对成熟生物膜的效力^3,8,9，或者将抗菌剂整合到材料表面，以评估该产品预防或减少生物膜形成的能力¹⁰。第三步取....

方案

1. 涡旋振荡与超声处理

1. 根据 ASTM 标准 E2562² 培养成熟的 P. aeruginosa ATCC 15442 生物膜。
2. 在 48 小时培养期结束后，按照 ASTM 标准 E2871⁸ 准备对生物膜和样本载片进行处理和取样。
3. 使用经火焰灭菌的镊子，将已高压灭菌的防溅罩无菌地插入无菌的 50 mL 锥形管中。对所有需要接受处理的试管重复此操作。对照组载片所用的试管无需防溅罩。
4. 从 CDC 生物膜反应器中无菌取出一根随机选择的转轴，将载片通过轻轻浸入 30 mL 无菌缓冲水中的方式冲洗，以去除松散附着的细胞。
5. 将转轴平行持于台面之上，置于一个空的无菌 50 mL 锥形管上方，使用经火焰灭菌的内六角扳手松开固定螺钉，使带有生物膜的载片落入管中。根据所需数量重复此步骤。取下防溅罩并放入单独容器中待灭菌。
6. 使用 5 mL 移液管，缓慢将 4 mL 处理液或对照液沿管壁加入试管中，使液体沿管内壁流下。
7. 轻轻敲击试管底部，以排除载片下方的任何气泡。每次加样后间隔 30–60 秒。
8. 在规定的接触时间结束时，按照之前施加处理液（或对照液）的相同顺序，向各试管中加入 36 mL 中和剂。
   注意：处理液与中和剂的最终总体....

结果

收获方法的验证/确认
我们实验室开展的多项研究考察了涡旋振荡和超声处理在生物膜反应器（ASTM E2562）中利用单管法（ASTM E2871）有效收获生物膜的能力²⁸。

根据 ASTM E2562² 标准，在硼硅酸盐玻璃片上培养 P. aeruginosa ATCC 15442 生物膜。培养 48 小时后，将四片玻璃片放入试管中，用 4 mL 无菌缓冲水“处理”，并加入 36 mL 2×D/E 中和肉汤进行中和。采用初始超声参数：45 kHz、10% 功率、扫描模式（Sweep setting），超声时间 30 ± 5 秒，用于从四片玻璃片中的三片上回收并分散生物膜。完成涡旋和超声处理后，对每片玻璃片进行结晶紫染色并拍照。图 1 展示了经涡旋和超声处理后，三片玻璃片上残留生物膜的量，与对照组相比的结果。

讨论

生物膜收获与分散方法的最低信息要求
为了在科学界范围内获得可重复的生物膜数据，作者必须尽可能详细地描述生物膜实验方法中的每一个生长、处理、取样和分析步骤。生物膜方法的标准化有助于实现这一目标，因为它允许研究人员引用特定方法以及任何相关的修改。然而，许多论文仅用一两句话来描述生物膜的收获和分散过程。为了提高实验的可重复性，我们建议在发表文献中包含生物膜收获的最低信息要求。这一建议基于Lourenco等人提出的“生物膜实验最低信息标准”（Minimum Information About a Biofilm Experiment, MIABiE）倡议¹⁷。若采用超声处理进行生物膜的收获与分散，应报告以下参数信息：试管在水浴中的位置（应遵循制造商建议，以避免损坏换能器）、同时超声处理的试管数量、试管材质、管内液体的体积和类型、是否含有表面活性剂、管内液面相对于超声水浴液面的位置、用于固定试管的装置（如玻璃烧杯或试管架）、超声前是否对水浴进行脱气处理（若设备无自动脱气功能，可在放入样品前先运行水浴一段时间，以去除部分溶解气体）、水浴温度（长时间超声可能.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
50 mL 锥形瓶	Thermo Scientific	339652
100 mL 玻璃烧杯	Fisher Scientific	FB102100
5 mL 血清移液管	Fisher Scientific	13-678-12D	用于向含有试片的瓶中添加处理液。
50 mL 血清移液管	Fisher Scientific	13-678-14C	在处理接触时间结束时，用于向瓶中添加中和剂。
涂布棒	Puritan	807
止血钳	Fisher Scientific	16-100-115
金属刮刀	Fisher Scientific	14-373
PTFE 刮棒	Saint-Gobain	06369-04
S 10 N - 10 G - ST 分散工具	IKA	4446700	用于生物膜样品的均质化。
剪刀	Fisher Scientific	08-951-20
硅胶导尿管，16 法国号	Medline Industries	DYND11502
硅胶管，16 号	Cole-Parmer	EW96400-16
防溅罩	BioSurface Technologies, Inc.	CBR 2232
T 10 basic ULTRA-TURRAX 分散器	IKA	3737001	用于生物膜样品的均质化。
管路连接器	Cole-Parmer	EW02023-86
超声波清洗机	Elma	TI-H15
Vortex-Genie 2 漩涡振荡器	Scientific Industries	SI-0236
Vortex-Genie 2 垂直 50 mL 试管架	Scientific Industries	SI-V506