Summary
本文详细介绍了在两种表面类型上展示三种常见生物膜收获和解聚技术的方法，收获方法的坚固性测试以及在选择和优化收获和分解技术以提高可重复性时要考虑的最少信息。
Abstract
生物膜方法包括四个不同的步骤：在相关模型中生长生物膜，处理成熟的生物膜，从表面收获生物膜并分解团块，以及分析样品。在这四个步骤中，收获和分解是研究最少的，但在考虑测试偏差的可能性时仍然至关重要。本文演示了在三种不同表面上生长的生物膜的常用收获和解聚技术。从广泛的文献综述中收集的三种生物膜收获和解聚技术包括涡旋和超声处理，刮削和均质化，以及刮擦，涡旋和超声处理。考虑两种表面类型：硬质无孔（聚碳酸酯和硼硅酸盐玻璃）和多孔（硅胶）。此外，我们还提供了在报告所遵循的收获技术时应包含的最少信息的建议，以及检查偏差的随附方法。
Introduction
生物膜的定义在过去几十年中不断发展，包括微生物与各种生物和/或非生物表面的关联，包括基质中显示不同生长和遗传表达的非细胞成分12。生物膜提供保护，免受干燥等环境压力，并可能使化学消毒剂的作用效果降低，从而导致微生物的存活。生物膜中的幸存者可能会提供致病微生物的来源，这些微生物是公共卫生问题3。
生物膜方法由四个步骤组成，生长，处理，采样（收获和分解）和分析。生长是用户确定生物体生长条件、温度、培养基等的第一步，是生物膜文献4，5，6，7中考虑和报告最多的步骤。该处理步骤评估抗菌剂（例如，消毒剂）以确定其对成熟生物膜3，8，9的功效，或者可以将抗菌剂掺入表面以确定产物防止或减少生物膜生长的能力10。第三步，取样，包括从其生长的表面收获生物膜的步骤，并对去除的团块进行分类3，8，11。第四步，分析，可能包括活细胞计数，显微镜检查，荧光测量，分子结果和/或基质成分评估8，9。数据评估提供有关实验结果的信息。在这四种方法中，采样通常是最容易被忽视的步骤，因为它假定所选的生物膜收获和/或分解技术是100%有效的，通常无需验证11。
通常被认为是均质的细菌浮游悬浮液在分析之前需要简单的涡旋。然而，生物膜是由微生物（原核和/或真核）、外多糖、蛋白质、脂质、细胞外DNA和宿主细胞组成的复杂群落12。需要采取超越传统浮游微生物培养方法的步骤，以便从表面充分收获生物膜，然后将其分解成均匀的单细胞悬浮液。广泛的文献综述（本出版物中未包含的信息）表明，去除和解聚技术的选择取决于许多因素，包括生物膜中存在的物种，生物膜附着的表面（无孔或多孔），生长表面的可及性（易于去除的优惠券或生物膜生长的设备的物理破坏）， 表面几何形状（面积和形状），生长表面上生物膜的密度以及可用的实验室设备。
当从表面收获生物膜时，产生的细胞悬浮液是非均性的。如果要准确枚举这种不均匀的悬浮液，则必须将其分解为单个单元格。活板计数假设菌落形成单元来自一种细菌。如果将生物膜的聚集体放置在生长培养基上，则无法区分可能导致不准确估计的单个细胞。例如，在消毒剂功效测试期间，如果与对照组相比，处理非常有效地从表面上去除生物膜，则与对照组相比，对数减少可能显得人为地大。另一方面，与对照组相比，将生物膜固定在表面上的化学消毒剂似乎具有较低的对数减少率11。这种类型的情况可能导致对实验数据的偏见解释。
在准备出版时，对文献的回顾确定，收获和分解生物膜的常见方法包括刮擦，拭子，超声处理，涡旋或这些的组合。刮擦被定义为用无菌棒，刮刀或其他工具从表面上物理去除生物膜。擦拭是指用棉签或其他固定吸收材料从表面上去除生物膜。超声处理是指通过分布在水中的超声波破坏表面的生物膜。涡旋是指使用混合器实现管内样品的液体涡流。均质化使用旋转叶片将收获的生物膜团块剪切成单个细胞悬浮液。在本文中，我们提出了两种不同表面类型的收获和解聚方法，即硬/无孔和多孔。
提供了研究人员应在出版物的方法部分包括的建议最低限度信息清单。我们希望包含这些信息使其他研究人员能够重现他们的工作。没有完美的收获和分解方法，因此，还提供了有关如何检查该技术的建议。
本文演示了从常见生长表面收获和分解生物膜的三种常用方法。这些信息将使研究人员能够更好地了解生物膜测试方法的整体精度和偏差。描述的方法如下：（1）在CDC生物膜反应器中高流体剪切下在聚碳酸酯试样（坚硬的非多孔表面）上生长的 铜绿假单胞菌 生物膜在涡旋和超声处理的五步组合后收获和解分解，以实现生物膜收获和解聚（2）铜 绿假单胞菌 在低流体剪切作用下，在滴流反应器中硼硅酸盐玻璃试样（坚硬的非多孔表面）上生长的生物膜被收获并使用刮擦和均质化进行分解（3）在硅胶管（多孔表面）中生长 的大肠杆菌 生物膜被收获并使用刮擦分解，然后进行超声处理和涡旋。
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Protocol
1. 涡旋和超声处理
- 生长成熟的铜绿假单胞菌ATCC 15442生物膜，根据ASTM标准E25622生长。
- 在48小时生长期结束时，准备根据ASTM标准E28718处理生物膜和样品试样
- 使用火焰灭菌镊子将高压灭菌的防溅罩无菌插入无菌的50 mL锥形管中。对所有将要接受治疗的管子重复上述步骤。用于控制优惠券的管子不需要防溅罩。
- 无菌地从CDC生物膜反应器中取出随机选择的棒。冲洗试样，通过将棒轻轻浸入30 mL无菌缓冲水中来去除松散附着的细胞。
- 将杆平行于工作台顶部，放在空的无菌50 mL锥形管上，并使用火焰灭菌的艾伦扳手，松开固定螺钉，将生物膜涂层的试样放入管中。重复所需数量的优惠券。取下防溅罩，放入单独的容器中进行灭菌。
- 使用5 mL血清学移液器，将4 mL的治疗或对照组缓慢移液到试管中，使液体沿着管壁内侧流动。
- 轻轻敲击管的底部，使试样下的任何气泡都被置换。每次添加之间允许 30 - 60 秒。
- 在指定的接触时间结束时，将36 mL中和剂移液到管中，其顺序与施加处理（或对照）的顺序相同。
注意：联合处理和中和剂的最终体积对于准确确定生物膜对数密度非常重要。 - 在最高设置下涡旋每个管子30±5秒。确保实现完全涡旋。
注意：在可能发生破损的玻璃小瓶中涡旋重试样（例如不锈钢）时，应谨慎行事。 - 在处理实际样品之前，确定每个浴槽的最佳管数和试管架内的位置。如果处理多个样品，请确认超声处理槽中的水温为21±2 oC。
- 将管子放在悬挂在脱气超声仪中的管架中，使浴中的水位等于管中的液位。以 45 kHz、100% 功率和正常功能超声处理 30 ± 5 秒。重复涡旋和超声检查循环，然后以最终涡旋结束（总共5个循环）。
注意：这些具有收获和分解的生物膜的管子是100或0稀释。 - 在缓冲水中连续稀释样品。使用适当的电镀方法在R2A琼脂上平板。在36±2 oC下孵育24小时。根据所使用的电镀方法对菌落进行计数并记录数据。
2. 刮削和均质化
- 根据ASTM标准E264713培养成熟的铜绿假单胞菌ATCC 15442生物膜。
- 设置采样站，包括采样板，烧杯中的95%乙醇，酒精燃烧器，止血器，试样去除工具，带有无菌稀释水的烧杯和用于冲洗试样的稀释管。
- 关闭泵。取下通道盖，并使用无菌试样取出工具和止血剂取出检票，注意不要干扰生物膜。
- 通过以流体运动轻轻浸入45mL无菌稀释水（包含在50 mL离心管中）来冲洗试样。立即反转动作以删除优惠券。
- 将试样放入装有45 mL无菌稀释水的烧杯中。使用无菌刮刀或刮刀向下刮擦生物膜覆盖的试样表面约15秒。通过在烧杯中搅拌来冲洗刮刀或刮刀。重复刮擦和漂洗过程3-4次，确保完全覆盖试样表面。
- 将试样以60°角放在无菌烧杯上，并在试样表面上移液1mL无菌稀释水，以冲洗试样。重复，共冲洗 5 次。烧杯中的最终体积为50 mL。
注意：联合处理和中和剂的最终体积对于准确确定生物膜对数密度非常重要。 - 卸下优惠券时，请更换每个通道盖。
- 在生物安全柜中工作，使刮下的生物膜样品均质化。将无菌均质机探头连接到均质机上，将探针尖端放入液体中，打开均质机并升压至20，500 rpm。
- 将样品匀浆30秒。调低转速并关闭均质器。
- 如上所述，通过以20，500 rpm的无菌稀释空白均质化9 mL，持续30秒，对生物膜样品之间的探针进行消毒。将9 mL的70%乙醇管匀浆30秒，分离探针，在乙醇管中静置1分钟。均质化两个额外的稀释坯料。
注：每个样品均可使用一次性均质探头。 - 在缓冲水中连续稀释样品。使用适当的电镀方法在R2A琼脂上平板。将板在36±2oC下孵育24小时，根据所使用的电镀方法适当计数菌落并记录数据。
3. 刮擦、涡旋和超声处理
- 在硅胶导管中培养成熟的 大肠杆菌 ATCC 53498 生物膜10。
- 准备取样材料：冲洗管，无菌离心管，空无菌培养皿，火焰灭菌不锈钢止血器和剪刀，计时器和尺子。
- 在泵暂停的情况下，使用70%乙醇清洁管道外部。从末端测量 2 cm，避开连接到连接器的区域，并标记卡套管以确定切割位置。
- 用火焰灭菌剪刀，将管子切成2厘米的标记，然后将管段放入空的无菌培养皿中。用70%乙醇擦拭管子，然后将远端重新连接到废旧管。
- 冲洗管段以去除浮游细胞。使用火焰灭菌镊子，将管段轻轻浸入 20 mL 无菌稀释水中，然后立即取出。将片段放入 10 mL 中和器中。
- 使用火焰灭菌镊子，握住管段并用无菌木制涂抹器刮棍刮，直到刮掉管子的所有内部区域。偶尔在10 mL中和剂中冲洗棒，并将管段放回样品管中。刮擦的管段是100 或0稀释。
注意：联合处理和中和剂的最终体积对于准确确定生物膜对数密度非常重要。 - 在最高设置下涡旋每个管子30±5秒。将管子放在悬挂在超声仪中的管架中，使浴中的水位等于管中的液位。以 45 kHz、100% 功率和正常功能超声处理 30 ± 5 秒。重复涡旋和超声检查循环，然后以最终涡旋结束。
注意：该管具有收获的和解聚生物膜是100 稀释。 - 在缓冲水中连续稀释样品。使用适当的电镀方法在胰酸大豆琼脂上平板。
- 将板在36±2 oC下孵育24小时。根据所使用的电镀方法对菌落进行计数，记录数据并计算算术平均值。
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Representative Results
收获方法的验证/确认
在我们的实验室进行的几项研究检查了涡旋和超声处理的能力，以有效收获使用单管法（ASTM E2871）8在生物膜反应器（ASTM E2562）2中生长的生物膜。
根据ASTM E25622在硼硅酸盐玻璃试样上生长铜绿假单胞菌ATCC 15442生物膜。48小时后，将四张试样放入小瓶中，用4mL无菌缓冲水“处理”，并用36mL2x D / E中和汤中和。初始超声处理设置为45 kHz，10%功率，扫描设置，30±5 s用于从四个试样中的三个中收集和分解生物膜。在涡旋和超声处理循环完成后，每个试样都用水晶紫染色并拍照。图1显示了与对照组相比，涡旋和超声处理后三个试样上剩余的生物膜量。
为了进一步测试这一点，如前所述生长了 铜绿假单胞 菌ATCC 15442生物膜，并比较了两种超声处理设置：1）45 kHz，10%功率，扫描设置，30±5秒和2）45 kHz，100%功率，正常设置，30±5秒。用BacLight活/死染色染色剂染色三组中的每组的一张优惠券，并使用共聚焦显微镜（CM）成像。将每组剩余的两个试样稀释，接种并枚举为活细胞。活板计数结果为9.230 Log10 CFU/试样±0.007（SD_R），9.272 Log10 CFU/优惠券±超声处理设置2为0.066（SD_R）。该数据证实了2015年EPA单管方法合作研究，其中实现了9.03 Log10 CFU /优惠券±0.272（SD_R）9。根据可行的平板计数，似乎所有三种均值都足够相似，因此不需要进一步研究两种收获方法之间的差异。然而， 图2 所示的微观图像可能表明，使用设置1后剩余的生物膜比设置2更多。虽然我们观察到优惠券上残留的生物膜看起来是死的（红色），但使用BacLight活/死染色时对生存能力的解释是困难的14，15。我们没有关注染色生物膜的生存能力影响，而是使用这种染色剂来可视化残留在表面上的生物膜。此外，虽然我们承认超声处理可能对细菌的生存能力有害，但Kobayashi等人2007年的一篇出版物表明， 超声处理时间超过5分钟会导致活板计数减少。由于我们的研究总共使用了1分钟的超声处理，因此我们确信很少有细胞通过超声处理被杀死，如两个超声处理参数的>9.2 LOG10 CFU / Coupon所示。有趣的是，这两种方法都没有从表面完全收获生物膜。这一发现表明，仅靠可行的平板计数不足以确定收获和分解偏倚，因此必须与另一种方法配对，例如显微镜。
除了超声仪设置外，我们还研究了影响超声处理的其他重要因素。其中包括小瓶中的液体体积（10 或 40 mL）、小瓶中的液体类型（缓冲水或 2X D/E 中和液）以及同时放入浴槽中的小瓶数量（3 或 12 个小瓶）9。
使用超声仪设置2（45 kHz，100%功率，正常设置，30±5秒）对CDC生物膜反应器试样上的铜绿假单胞菌生物膜进行超声处理。所有样品一次涡旋3个或6个使用装有6个管附件的涡旋器，然后如图3所示进行超声处理。使用CM对以下每个类别的优惠券进行成像（图3）。
在研究超声处理参数的第二项研究中，微观图像（图3）表明，最小化试管中的体积，减少一次处理的试管数量以及使用D / E中和肉汤（含有表面活性剂）都有助于增强从试样中收获生物膜。
杀菌剂可以积极或消极地促进收获和分解。与在进行功效测试之前确认中和剂有效停止活性而不增加杀伤力类似，重要的是要确认杀菌剂不会对收获和分解产生差异影响。对于功效测试，当且仅当对照与处理的生物膜样品存在差异去除时，才会产生偏倚结果11。
图1：用结晶紫染色的试样照片，显示残留的生物膜。 A）从反应器中取出试样并用结晶紫染色。B，C，D）用无菌缓冲水分别“处理”三个重复的优惠券，然后中和。为了收获和分解，将试样涡旋（30±5秒）并超声处理（45 kHz，10%功率，扫描设置，30±5秒）两次，然后收到最终涡流。图片由Danielle Orr和Blaine Fritz提供。 请点击此处查看此图的放大版本。
图2：比较两种不同超声处理设置的试样共聚焦显微镜图像。 通过左侧的超声处理设置 1（45 kHz，10% 功率，扫描设置）或右侧的超声处理设置 2（45 kHz，100% 功率，正常设置）处理的试样（12.5 倍放大倍率）。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 3.比较体积，超声处理液体和管数的试样共聚焦显微镜图像。 试样（12.5 倍放大倍率）以 10 或 40 mL 体积、稀释水 （DW） 或 D/E 中和肉汤 （D/E） 处理，一次处理 3 或 12 管，并具有优化的超声处理设置（45 kHz，100% 功率，正常设置）。 请点击此处查看此图的放大版本。
补充文件1：收获和分解的重要关键参数 请点击此处下载本文件。
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Discussion
收获和分解方法的最少信息
为了在整个科学界创建可重复的生物膜数据，作者必须尽可能多地提供有关生物膜方法的每个生长，处理，采样和分析步骤的详细信息。生物膜方法的标准化有助于这项工作，因为它允许研究人员参考特定方法和任何相关修改。然而，许多论文只包含一两句话来描述生物膜的收获和分解。为了获得更好的再现性，我们建议在出版物中包括生物膜收获的最少信息。这建立在Lourenco等人提出的关于生物膜实验（MIABiE）的最低限度信息（MIABiE）倡议的基础上。在使用超声处理进行生物膜收集和解聚参数的情况下，信息应包括：浴槽内管的位置（制造商关于避免损坏传感器的建议），同时超声处理的管数，管材料，管中液体的体积和类型，表面活性剂的存在，管中液体相对于超声波浴液液位的位置， 用于将管子固定在浴槽中的装置（玻璃烧杯与试管架），在对样品进行超声处理之前对水浴进行脱气（如果脱气不是制造商的选择，则在插入样品之前简单地操作浴槽将有助于从浴液中除去一些溶解的气体），水浴的温度（长时间超声处理后温度可能会升高）， 频率（例如 25 kHz 或 45 kHz）、浴槽功能（例如扫描或正常）和功率范围（例如 10 - 100%）。这些设置应针对正在研究的生物膜、用于生长生物膜的系统以及超声波浴的特定品牌/型号进行优化18。
可以更改声波器设置以优化所需的收获效果。脱气可去除浴液中的溶解空气，从而提高清洁能力。频率可以调节到低或高设置。例如，25 kHz等低设置将有助于收集顽强的样品，而较高的45 kHz设置则更适合敏感样品。扫描或正常浴功能允许气蚀分布。扫描功能可产生声压最大值的连续偏移。正常功能允许传感器在双半波模式下工作，这可能导致死区，从而使超声处理效率降低。功率范围可以从输送到传感器的功率的 10% - 100% 19 改变。众所周知，超声处理会对细菌的生存能力产生不利影响。Stamper等人2008年的一项研究将 细菌培养物暴露于随时间推移而增加的超声波能量中，以产生细菌杀伤曲线。我们建议用户确认超声处理设置的特定组合不会导致活细菌减少20。
没有一种完美的方法来收获和分解生物膜，但特定方法确实比其他方法更适合某些表面/微生物组合。我们提倡读者确定哪些参数对于其特定的生物膜场景很重要。对于收获和分类具有重要意义的关键参数包含在 补充文件 1 中。
对于为评估收获和解聚偏差而进行的超声处理研究，我们发现超声处理方便，高效，并且能够标准化用于从表面收获和分解生物膜。例如，将试样放置在小瓶中可以最大限度地减少技术人员与技术人员之间的差异，例如，在实验室人员物理刮擦优惠券的方法中会遇到这种变异性。尽管将小瓶放入超声水浴中似乎很简单，但要实现生物膜的最佳收获，需要考虑许多参数。
有两种类型的超声设备可供选择，超声波浴和超声波探头。本文主要关注超声波浴，其中超声波能量在高（20 - 45 kHz）至正常（40 - 60 Hz）频率范围内产生。
使用超声波设备清洁表面时，有三个主要过程在起作用。当高频电流被发送到响应电流而振荡的压电或磁致伸缩传感器时，电能被转换为声能。振荡在液体中产生压缩（稀疏）波。气蚀气泡是由于稀疏过程中的负压而形成的。气泡会一直生长到不稳定的大小并坍塌，从而产生清洁表面的水射流21。
本文演示了三种收获和解聚方法：根据单管法在CDC生物膜反应器中聚碳酸酯试样上生长时，用于收获和分解生物膜的超声处理和涡旋方法。当使用滴灌流生物膜反应器在玻璃试样上生长时，显示了用于收获和分解生物膜的刮擦和均质方法。在硅胶管中生长时，显示了用于收获和分解生物膜的刮擦，超声处理和涡旋方法。
没有完美的方法来收获和分解生物膜，但有些方法更适合不同的表面和/或应用。重要的是花时间验证所使用的方法。在本文中，我们讨论了晶体紫和显微镜的使用，但根据所需的灵敏度，存在其他选择。如果研究包括功效测试，那么在存在抗菌素的情况下确认该方法的有效性至关重要6。所有设备都略有不同，因此即使收获和分解方法已经标准化，确认所用设备的工艺仍然是谨慎的。收获和解聚方法特定于表面相关细菌和生物膜细菌。研究表明，不正确的选择可能会导致有偏见的测试结果。尽管如此，收获和分解是生物膜方法四个步骤中研究最少的。它通常也是未经验证的步骤（理所当然地认为是有效的），已发表论文中存在的信息最少，因此在不同的实验室中重现该过程具有挑战性。本文和随附的视频展示了两种表面类型的三种常见方法，并建议如何验证单个实验室的方法。这些信息将帮助研究人员就使用哪种方法做出更明智的决定，并就报告什么以提高可重复性提供指导。
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Disclosures
作者没有披露。
Acknowledgments
我们要感谢Danielle Orr Goveia，Blaine Fritz，Jennifer Summers和Fei San Lee对本文的贡献。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL conical vials | Thermo Scientific | 339652 | |
| 100 mL glass beakers | Fisher Scientific | FB102100 | |
| 5 mL serological pipettes | Fisher Scientific | 13-678-12D | For adding treatment to vials containing coupons. |
| 50 mL serological pipettes | Fisher Scientific | 13-678-14C | For adding neutralizer to vials at the end of treatment contact time. |
| Applicator sticks | Puritan | 807 | |
| Hemostats | Fisher Scientific | 16-100-115 | |
| Metal spatula | Fisher Scientific | 14-373 | |
| PTFE policemen | Saint-Gobain | 06369-04 | |
| S 10 N - 10 G - ST Dispersing tool | IKA | 4446700 | For homogenization of biofilm samples. |
| Scissors | Fisher Scientific | 08-951-20 | |
| Silicone Foley catheter, size 16 French | Medline Industries | DYND11502 | |
| Silicone tubing, size 16 | Cole-Parmer | EW96400-16 | |
| Splash Guards | BioSurface Technologies, Inc. | CBR 2232 | |
| T 10 basic ULTRA-TURRAX Disperser | IKA | 3737001 | For homogenization of biofilm samples. |
| Tubing connectors | Cole-Parmer | EW02023-86 | |
| Ultrasonic Cleaner | Elma | TI-H15 | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Vortex-Genie 2 Vertical 50 mL Tube Holder | Scientific Industries | SI-V506 |
References
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