Summary
यह पेपर उन तरीकों का विवरण देता है जो दो सतह प्रकारों पर तीन सामान्य बायोफिल्म कटाई और भेदभाव तकनीकों को प्रदर्शित करते हैं, एक कटाई विधि का बीहड़ता परीक्षण और न्यूनतम जानकारी पर विचार करने के लिए जब कटाई और विभेदन तकनीकों को चुनने और अनुकूलित करने के लिए पुनरुत्पादन बढ़ाने के लिए।
Abstract
बायोफिल्म विधियों में चार अलग-अलग चरण होते हैं: एक प्रासंगिक मॉडल में बायोफिल्म को बढ़ाना, परिपक्व बायोफिल्म का इलाज करना, सतह से बायोफिल्म की कटाई करना और clumps को अलग करना, और नमूने का विश्लेषण करना। चार चरणों में से, कटाई और भेदभाव कम से कम अध्ययन किया जाता है लेकिन फिर भी परीक्षण पूर्वाग्रह की क्षमता पर विचार करते समय महत्वपूर्ण होता है। यह लेख तीन अलग-अलग सतहों पर उगाए गए बायोफिल्म के लिए आमतौर पर उपयोग की जाने वाली कटाई और भेदभाव तकनीकों को दर्शाता है। तीन biofilm कटाई और disaggregation तकनीकों, एक व्यापक साहित्य की समीक्षा से gleaned, भंवर और sonication, स्क्रैपिंग और homogenization, और scraping, भंवर और sonication शामिल हैं। दो सतह प्रकारों पर विचार किया जाता है: हार्ड गैर-झरझरा (पॉली कार्बोनेट और बोरोसिलिकेट ग्लास) और झरझरा (सिलिकॉन)। इसके अतिरिक्त, हम न्यूनतम जानकारी के लिए सिफारिशें प्रदान करते हैं जिन्हें कटाई तकनीक की रिपोर्ट करते समय शामिल किया जाना चाहिए और पूर्वाग्रह की जांच करने के लिए एक साथ विधि।
Introduction
बायोफिल्म की परिभाषा पिछले कुछ दशकों में विकसित हुई है और इसमें विभिन्न प्रकार की जैविक और / या गैर-जैविक सतहों के साथ माइक्रोबियल एसोसिएशन शामिल है, जिसमें गैर-कोशिकीय घटकों को शामिल किया गया है1 जो मैट्रिक्स के भीतर अलग-अलग विकास और आनुवंशिक अभिव्यक्ति 2 प्रदर्शित करते हैं। बायोफिल्म सूखने जैसे पर्यावरणीय तनावों से सुरक्षा प्रदान करता है और रासायनिक कीटाणुनाशकों की कार्रवाई को कम प्रभावी बना सकता है जिसके परिणामस्वरूप रोगाणुओं का अस्तित्व होता है। एक बायोफिल्म के भीतर बचे लोग संभावित रूप से रोगजनक सूक्ष्मजीवों का एक स्रोत प्रदान कर सकते हैं जो एक सार्वजनिक स्वास्थ्य चिंता का विषय हैं3।
बायोफिल्म विधियों में चार चरण शामिल हैं, विकास, उपचार, नमूनाकरण (कटाई और भेदभाव), और विश्लेषण। विकास, पहला कदम, जहां उपयोगकर्ता जीव विकास की स्थिति, तापमान, मीडिया, आदि को निर्धारित करता है, बायोफिल्म साहित्य 4,5,6,7 में सबसे अधिक माना जाता है और रिपोर्ट किया जाता है। उपचार चरण रोगाणुरोधी (जैसे, कीटाणुनाशक) का मूल्यांकन करता है ताकि उनकी प्रभावकारिता को निर्धारित किया जा सके या तो एक परिपक्व बायोफिल्म 3,8,9 के खिलाफ या रोगाणुरोधी को बायोफिल्म विकास को रोकने या कम करने के लिए उत्पाद की क्षमता निर्धारित करने के लिए सतह में शामिल किया जा सकता है। तीसरा चरण, नमूनाकरण, उस सतह से बायोफिल्म की कटाई के लिए कदम शामिल है जिस पर यह बढ़ रहा था और हटाए गए clumps3,8,11 को अलग करने के लिए। चौथा चरण, विश्लेषण, व्यवहार्य सेल गिनती, माइक्रोस्कोपी, प्रतिदीप्ति माप, आणविक परिणाम, और / या एक मैट्रिक्स घटक मूल्यांकन 8,9 शामिल हो सकता है। डेटा का मूल्यांकन एक प्रयोग के परिणाम के बारे में जानकारी प्रदान करता है। चार में से, नमूनाकरण अक्सर सबसे अनदेखा कदम होता है क्योंकि यह मानता है कि चुनी गई बायोफिल्म कटाई और / या भेदभाव तकनीक 100% प्रभावी है, अक्सर सत्यापन के बिना।
बैक्टीरिया के प्लवक निलंबन, जिसे अक्सर समरूप माना जाता है, को विश्लेषण से पहले सरल भंवर की आवश्यकता होती है। बायोफिल्म्स, हालांकि, सूक्ष्मजीवों (प्रोकैरियोटिक और / या यूकेरियोटिक), एक्सोपॉलीसेकेराइड्स, प्रोटीन, लिपिड, एक्स्ट्रासेल्युलर डीएनए और मेजबान कोशिकाओं से बने जटिल समुदाय हैं। पारंपरिक प्लवक सूक्ष्मजीवविज्ञानी संस्कृति विधियों से परे कदम उठाने के लिए पर्याप्त रूप से एक सतह से बायोफिल्म की कटाई करने के लिए आवश्यक हैं और फिर इसे एक समरूप एकल सेल निलंबन में अलग करते हैं। एक व्यापक साहित्य समीक्षा (इस प्रकाशन में शामिल नहीं जानकारी) ने प्रदर्शित किया कि हटाने और भेदभाव तकनीक का विकल्प कई कारकों पर निर्भर करता है, जिसमें बायोफिल्म में मौजूद प्रजातियां शामिल हैं, सतह जो बायोफिल्म से जुड़ी हुई है (गैर-झरझरा या झरझरा), विकास सतहों तक पहुंच (आसानी से हटाने योग्य कूपन या उपकरण का भौतिक विनाश जिसमें बायोफिल्म बढ़ रहा है), सतह ज्यामिति (क्षेत्र और आकार), विकास सतहों पर बायोफिल्म का घनत्व, और उपलब्ध प्रयोगशाला उपकरण।
जब बायोफिल्म को एक सतह से काटा जाता है, तो परिणामी सेल निलंबन विषम होता है। यदि इस nonuniform निलंबन सही गणना की जा करने के लिए है, तो यह अलग-अलग कोशिकाओं में disaggregated किया जाना चाहिए। व्यवहार्य प्लेट गिनती यह मानती है कि एक कॉलोनी बनाने वाली इकाई एक जीवाणु से उत्पन्न होती है। यदि बायोफिल्म के समुच्चय को विकास माध्यम पर रखा जाता है, तो व्यक्तिगत कोशिकाओं को अलग करना असंभव है जो गलत अनुमानों को जन्म दे सकता है। उदाहरण के लिए, कीटाणुनाशक प्रभावकारिता परीक्षण के दौरान, यदि कोई उपचार नियंत्रण की तुलना में सतह से बायोफिल्म को बहुत प्रभावी ढंग से हटा देता है, तो नियंत्रण की तुलना में लॉग में कमी कृत्रिम रूप से बड़ी दिखाई दे सकती है। दूसरी ओर, एक रासायनिक कीटाणुनाशक जो नियंत्रण की तुलना में एक सतह पर बायोफिल्म को ठीक करता है, वह कम लॉग रिडक्शन 11 प्रतीत होगा। इस प्रकार के परिदृश्य से प्रयोगात्मक डेटा की पक्षपातपूर्ण व्याख्या हो सकती है।
प्रकाशन की तैयारी में, साहित्य की समीक्षा ने निर्धारित किया कि कटाई और अलग-अलग बायोफिल्म के लिए सामान्य दृष्टिकोणों में स्क्रैपिंग, स्वैबिंग, sonication, भंवर या इनमें से एक संयोजन शामिल है। स्क्रैपिंग को एक बाँझ छड़ी, स्पैटुला या अन्य उपकरण के साथ सतहों से बायोफिल्म के भौतिक निष्कासन के रूप में परिभाषित किया गया है। स्वैबिंग एक कपास इत्तलादार छड़ी या अन्य निश्चित अवशोषक सामग्री के साथ सतहों से बायोफिल्म को हटाने को संदर्भित करता है। Sonication पानी के माध्यम से वितरित अल्ट्रासोनिक तरंगों के माध्यम से सतहों से बायोफिल्म के विघटन को संदर्भित करता है। भंवर एक ट्यूब के अंदर नमूने के तरल भंवर को प्राप्त करने के लिए एक मिक्सर के उपयोग को संदर्भित करता है। Homogenization एक एकल सेल निलंबन में काटा biofilm clumps कतरनी करने के लिए घूर्णन ब्लेड का उपयोग करता है। इस पेपर में, हम दो अलग-अलग सतह प्रकारों, हार्ड / गैर-झरझरा और झरझरा के लिए तीन कटाई और भेदभाव विधियों को प्रस्तुत करते हैं।
अनुशंसित न्यूनतम जानकारी की एक सूची जो शोधकर्ताओं को प्रकाशनों के तरीकों के अनुभागों में शामिल करनी चाहिए, प्रदान की जाती है। हम आशा करते हैं कि इस जानकारी को शामिल करने से अन्य शोधकर्ताओं को अपने काम को पुन: पेश करने में सक्षम बनाता है। कोई सही कटाई और भेदभाव विधि नहीं है, इसलिए, तकनीक की जांच करने के तरीके के लिए सिफारिशें भी प्रदान की जाती हैं।
आम विकास सतहों से बायोफिल्म को काटने और अलग करने के लिए तीन सामान्य तरीकों को इस लेख में प्रदर्शित किया गया है। यह जानकारी शोधकर्ताओं को बायोफिल्म परीक्षण विधि की समग्र सटीकता और पूर्वाग्रह को बेहतर ढंग से समझने में सक्षम बनाएगी। वर्णित तरीके इस प्रकार हैं: (1) सीडीसी बायोफिल्म रिएक्टर में उच्च तरल पदार्थ कतरनी के तहत पॉली कार्बोनेट कूपन (हार्ड गैर-झरझरा सतह) पर उगाए गए एक स्यूडोमोनास एरुगिनोसा बायोफिल्म को काटा जाता है और बायोफिल्म फसल और विघटन प्राप्त करने के लिए भंवर और sonication के पांच चरण संयोजन के बाद अलग किया जाता है (2) ए पी एरुगिनोसा कम तरल कतरनी के तहत ड्रिप प्रवाह रिएक्टर में बोरोसिलिकेट ग्लास कूपन (हार्ड गैर-झरझरा सतह) पर उगाई गई बायोफिल्म को काटा जाता है और स्क्रैपिंग और होमोजेनाइजेशन (3) सिलिकॉन ट्यूबिंग (झरझरा सतह) में उगाए गए एक एस्चेरिचिया कोलाई बायोफिल्म को काटा जाता है और स्क्रैपिंग का उपयोग करके अलग किया जाता है, इसके बाद sonication और vortexing होता है।
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Protocol
1. भंवर और sonication
- एक परिपक्व पी aeruginosa ATCC 15442 biofilm ASTM मानक E25622 के अनुसार उगाया बढ़ो.
- 48 ज विकास अवधि के अंत में, एएसटीएम मानक E28718 के अनुसार बायोफिल्म और नमूना कूपन का इलाज करने के लिए तैयार करें
- Aseptically लौ-sterilized संदंश का उपयोग कर बाँझ 50 mL शंक्वाकार ट्यूबों में autoclaved छप गार्ड डालें। उपचार प्राप्त करने वाले सभी ट्यूबों के लिए दोहराएं। नियंत्रण कूपन के लिए ट्यूबों को एक छप गार्ड की आवश्यकता नहीं है।
- Aseptically सीडीसी बायोफिल्म रिएक्टर से एक यादृच्छिक रूप से चयनित रॉड को हटा दें। धीरे से बाँझ buffered पानी के 30 मिलीलीटर में रॉड डुबकी द्वारा ढीले संलग्न कोशिकाओं को हटाने के लिए कूपन कुल्ला.
- एक खाली, बाँझ 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब पर बेंच टॉप के समानांतर रॉड पकड़ो और एक लौ-निष्फल एलन रिंच का उपयोग करके, ट्यूब में एक बायोफिल्म लेपित कूपन छोड़ने के लिए सेट स्क्रू को ढीला करें। कूपन की वांछित संख्या के लिए दोहराएँ। स्प्लैश गार्ड निकालें और नसबंदी के लिए एक अलग कंटेनर में रखें।
- 5 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके, धीरे-धीरे ट्यूबों में उपचार या नियंत्रण के 4 मिलीलीटर पिपेट करें ताकि तरल ट्यूब की दीवार के अंदर नीचे बह जाए।
- धीरे से ट्यूब के नीचे नल इतना है कि कूपन के नीचे किसी भी हवा के बुलबुले विस्थापित कर रहे हैं. प्रत्येक अतिरिक्त के बीच 30 - 60 s की अनुमति दें।
- निर्दिष्ट संपर्क समय के अंत में, पाइपेट 36 मिलीलीटर न्यूट्रलाइज़र को उसी क्रम में ट्यूबों में डाल दिया जाता है जिस क्रम में उपचार (या नियंत्रण) लागू किया गया था।
नोट: संयुक्त उपचार और न्यूट्रलाइज़र की अंतिम मात्रा बायोफिल्म लॉग घनत्व को सटीक रूप से निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है। - भंवर 30 ± 5 s के लिए उच्चतम सेटिंग पर प्रत्येक ट्यूब. सुनिश्चित करें कि एक पूर्ण भंवर प्राप्त किया गया है।
नोट: सावधानी बरतनी चाहिए जब कांच की शीशियों में स्टेनलेस स्टील जैसे भारी कूपन भंवर जहां टूटना हो सकता है। - वास्तविक नमूनों को संसाधित करने से पहले टेस्ट ट्यूब रैक के भीतर स्नान और प्लेसमेंट प्रति ट्यूब ट्यूबों की इष्टतम संख्या निर्धारित करें। यदि कई नमूनों को संसाधित करते हैं, तो पुष्टि करें कि sonicating स्नान में पानी का तापमान 21 ± 2 डिग्री सेल्सियस है।
- ट्यूब रैक में ट्यूबों को degassed sonicator में निलंबित रखें ताकि स्नान में पानी का स्तर ट्यूबों में तरल स्तर के बराबर हो। 45 kHz पर Sonicate, 100% शक्ति और 30 ± 5 s के लिए सामान्य समारोह। भंवर और sonication चक्र को दोहराएँ और फिर एक अंतिम भंवर (5 चक्र कुल) के साथ समाप्त होता है।
नोट: काटे गए और अलग-अलग बायोफिल्म के साथ ये ट्यूब100 या 0 कमजोर पड़ने वाले हैं। - बफ़र्ड पानी में क्रमिक रूप से पतला नमूना। उचित चढ़ाना विधि का उपयोग कर R2A आगर पर प्लेट. 24 घंटे के लिए 36 ± 2 oC पर इनक्यूबेट करें। उपयोग की गई विधि को चढ़ाना और डेटा रिकॉर्ड करने के लिए उपयुक्त के रूप में कॉलोनियों की गणना करें।
2. स्क्रैपिंग और homogenization
- ASTM मानक E264713 के अनुसार एक परिपक्व P. aeruginosa ATCC 15442 biofilm बढ़ो।
- नमूना बोर्ड, एक बीकर में 95% इथेनॉल, अल्कोहल बर्नर, हेमोस्टैट्स, कूपन हटाने के उपकरण, बाँझ कमजोर पड़ने वाले पानी और कूपन को धोने के लिए कमजोर पड़ने वाली ट्यूबों के साथ बीकर शामिल करने के लिए नमूना स्टेशन की स्थापना करें।
- पंप बंद कर दें। एक चैनल कवर निकालें और कूपन को हटाने के लिए एक बाँझ कूपन हटाने उपकरण और हेमोस्टैट्स का उपयोग करें, सावधान रहें कि बायोफिल्म को परेशान न करें।
- एक तरल गति के साथ धीरे से विसर्जित करके कूपन कुल्ला, बाँझ कमजोर पड़ने के पानी के 45 मिलीलीटर में (एक 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में निहित)। कूपन को हटाने के लिए तुरंत गति को उलट दें।
- कूपन को एक बीकर में रखें जिसमें 45 मिलीलीटर बाँझ कमजोर पड़ने वाला पानी होता है। बायोफिल्म-कवर कूपन सतह को लगभग 15 सेकंड के लिए नीचे की दिशा में स्क्रैप करें, एक बाँझ स्पैटुला या स्क्रैपर का उपयोग करके। स्पैटुला या स्क्रैपर को बीकर में हिलाकर कुल्ला करें। स्क्रैपिंग और रिंसिंग प्रक्रिया को 3-4 बार दोहराएं, कूपन सतह का पूर्ण कवरेज सुनिश्चित करें।
- बाँझ बीकर पर एक 60 ° कोण पर इसे पकड़कर कूपन कुल्ला और कूपन की सतह पर बाँझ कमजोर पड़ने के पानी के 1 मिलीलीटर pipetting. कुल 5 कुल्ला के लिए दोहराएं। बीकर में अंतिम मात्रा 50 मिलीलीटर है।
नोट: संयुक्त उपचार और न्यूट्रलाइज़र की अंतिम मात्रा बायोफिल्म लॉग घनत्व को सटीक रूप से निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है। - कूपन निकाल दिए जाने के रूप में प्रत्येक चैनल कवर बदलें।
- Biosafety कैबिनेट में काम करते हुए, स्क्रैप किए गए बायोफिल्म नमूने को homogenize करें। homogenizer करने के लिए एक बाँझ homogenizer जांच संलग्न, तरल में जांच टिप जगह, homogenizer पर बारी और 20,500 आरपीएम तक रैंप.
- 30 s के लिए नमूने homogenize. आरपीएम को बंद करें और होमोजेनाइज़र को बंद कर दें।
- ऊपर वर्णित के रूप में 30 s के लिए 20,500 rpm पर बाँझ कमजोर पड़ने रिक्त के एक 9 mL homogenizing द्वारा biofilm नमूनों के बीच जांच को साफ करें। 30 s के लिए 70% इथेनॉल की एक 9 मिलीलीटर ट्यूब homogenize, जांच को अलग करें और 1 मिनट के लिए इथेनॉल ट्यूब में खड़े होने दें। Homogenize दो अतिरिक्त कमजोर पड़ने रिक्त स्थान.
नोट:: एक डिस्पोजेबल homogenizer जांच प्रत्येक नमूने के लिए उपयोग किया जा सकता है। - क्रमिक रूप से बफ़र्ड पानी में नमूनों को पतला करें। उचित चढ़ाना विधि का उपयोग कर R2A आगर पर प्लेट. 24 घंटे के लिए 36 ± 2oC पर प्लेटों को इनक्यूबेट करें, उपयोग की जाने वाली विधि को चढ़ाना और डेटा रिकॉर्ड करने के लिए उपयुक्त के रूप में कॉलोनियों की गिनती करें।
3. स्क्रैपिंग, भंवर और sonication
- सिलिकॉन कैथेटर टयूबिंग 10 में एक परिपक्व Escherichia कोलाई ATCC 53498 बायोफिल्म बढ़ो।
- नमूना सामग्री तैयार करें: कुल्ला ट्यूब, बाँझ सेंट्रीफ्यूज ट्यूब, खाली बाँझ पेट्री डिश, लौ निष्फल स्टेनलेस स्टील हेमोस्टैट और कैंची, टाइमर, और शासक।
- पंप को रोकने के साथ, टयूबिंग के बाहर को साफ करने के लिए 70% इथेनॉल का उपयोग करें। अंत से 2 सेमी मापें, कनेक्टर से जुड़े क्षेत्र से बचें, और काटने के स्थानों को निर्धारित करने के लिए टयूबिंग को चिह्नित करें।
- लौ sterilized कैंची के साथ, 2 सेमी निशान पर टयूबिंग काट और खाली बाँझ पेट्री पकवान में खंड जगह. 70% इथेनॉल के साथ टयूबिंग को पोंछें और अपशिष्ट टयूबिंग के लिए डिस्टल एंड को फिर से कनेक्ट करें।
- प्लवक कोशिकाओं को हटाने के लिए टयूबिंग सेगमेंट को कुल्ला करें। लौ निष्फल संदंश के साथ, धीरे से बाँझ कमजोर पड़ने वाले पानी के 20 मिलीलीटर में टयूबिंग सेगमेंट विसर्जित करें और फिर तुरंत हटा दें। सेगमेंट को 10 मिलीलीटर न्यूट्रलाइज़र में रखें।
- लौ निष्फल संदंश के साथ, टयूबिंग सेगमेंट को पकड़ो और बाँझ लकड़ी के एप्लिकेटर स्टिक के साथ स्क्रैप करें जब तक कि टयूबिंग के सभी आंतरिक क्षेत्रों को स्क्रैप नहीं किया गया है। कभी-कभी न्यूट्रलाइज़र के 10 मिलीलीटर में छड़ी को कुल्ला करें और सेगमेंट को नमूना ट्यूब में वापस रखें। स्क्रैप्ड टयूबिंग सेगमेंट 100 या 0 कमजोर पड़ने वाला है।
नोट: संयुक्त उपचार और न्यूट्रलाइज़र की अंतिम मात्रा बायोफिल्म लॉग घनत्व को सटीक रूप से निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है। - भंवर 30 ± 5 s के लिए उच्चतम सेटिंग पर प्रत्येक ट्यूब. ट्यूब रैक में ट्यूब को सोनिकेटर में निलंबित रखें ताकि स्नान में पानी का स्तर ट्यूबों में तरल स्तर के बराबर हो। 45 kHz पर Sonicate, 100% शक्ति और 30 ± 5 सेकंड के लिए सामान्य समारोह. भंवर और sonication चक्र तो एक अंतिम भंवर के साथ समाप्त दोहराएँ.
नोट: काटा और अलग biofilm के साथ इस ट्यूब 100 कमजोर पड़ने है. - क्रमिक रूप से बफ़र्ड पानी में नमूनों को पतला करें। Tryptic सोया आगर पर प्लेट उपयुक्त चढ़ाना विधि का उपयोग कर.
- 36 ± 24 घंटे के लिए 2 oC पर प्लेटों को इनक्यूबेट करें। उपयोग की जाने वाली विधि को चढ़ाना, डेटा रिकॉर्ड करने और अंकगणितीय माध्य की गणना करने के लिए उपयुक्त के रूप में कॉलोनियों की गणना करें।
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Representative Results
एक कटाई विधि का सत्यापन / पुष्टिकरण
हमारी प्रयोगशाला में आयोजित किए गए कई अध्ययनों ने एकल ट्यूब विधि (एएसटीएम ई 2871) 8 का उपयोग करके बायोफिल्म रिएक्टर (एएसटीएम ई 2562) 2 में उगाए गए बायोफिल्म को प्रभावी ढंग से फसल करने के लिए भंवर और sonication की क्षमता की जांच की।
ए पी aeruginosa ATCC 15442 बायोफिल्म बोरोसिलिकेट ग्लास कूपन पर ASTM E25622 के अनुसार उगाया गया था। 48 घंटों के बाद, चार कूपनों को शीशियों में रखा गया था, 4 एमएल बाँझ बफ़र्ड पानी के साथ "इलाज" किया गया था और 2x डी / ई न्यूट्रलाइज़िंग शोरबा के 36 मिलीलीटर के साथ बेअसर किया गया था। 45 kHz, 10% शक्ति, स्वीप सेटिंग, 30 ± 5 s की प्रारंभिक sonication सेटिंग फसल और चार कूपन में से तीन से biofilm disaggregate करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। भंवर और sonication चक्र के पूरा होने पर, प्रत्येक कूपन क्रिस्टल बैंगनी और फोटो खिंचवाने के साथ दाग दिया गया था। चित्रा 1 नियंत्रण की तुलना में भंवर और sonication के बाद तीन कूपन पर शेष biofilm की मात्रा को दर्शाता है।
इसे आगे परीक्षण करने के लिए, एक पी एरुगिनोसा एटीसीसी 15442 बायोफिल्म को पहले वर्णित के रूप में उगाया गया था और दो sonication सेटिंग्स की तुलना की गई थी: 1) 45 kHz, 10% पावर, स्वीप सेटिंग, 30 ± 5 सेकंड और 2) 45 kHz, 100% शक्ति, सामान्य सेटिंग, 30 ± 5 सेकंड। तीनों के प्रत्येक सेट से एक कूपन को BacLight Live / Dead stain के साथ दाग दिया गया था और confocal microscopy (CM) का उपयोग करके चित्रित किया गया था। प्रत्येक सेट से शेष दो कूपन को पतला, मढ़वाया गया और व्यवहार्य कोशिकाओं के लिए गणना की गई। व्यवहार्य प्लेट गिनती परिणाम 9.230 Log10 CFU / कूपन ± 0.007 (SD_R) 1 और 9.272 Log10 CFU / कूपन ± 0.066 (SD_R) sonication सेटिंग 2 के लिए सेटिंग के लिए थे। इस डेटा ने 2015 ईपीए सिंगल ट्यूब मेथड सहयोगी अध्ययन की पुष्टि की, जहां 9.03 Log10 CFU / कूपन ± 0.272 (SD_R) प्राप्त किया गया था। व्यवहार्य प्लेट की गिनती के अनुसार, ऐसा प्रतीत होता है कि सभी तीन साधन दो कटाई विधियों के बीच अंतर में आगे की जांच को वारंट नहीं करने के लिए पर्याप्त समान हैं। हालांकि, चित्र 2 में दिखाई गई सूक्ष्म छवियां यह सुझाव दे सकती हैं कि सेटिंग 2 की तुलना में सेटिंग 1 के उपयोग के बाद अधिक बायोफिल्म बनी रही। जबकि हम देखते हैं कि कूपन पर शेष बायोफिल्म मृत (रंग में लाल) दिखाई देता है, BacLight लाइव / मृत दाग का उपयोग करते समय व्यवहार्यता की व्याख्या मुश्किल है14,15। दाग बायोफिल्म की व्यवहार्यता निहितार्थ पर ध्यान केंद्रित करने के बजाय, हमने सतहों पर शेष बायोफिल्म की कल्पना करने के लिए इस दाग का उपयोग किया। इसके अतिरिक्त, जबकि हम स्वीकार करते हैं कि sonication जीवाणु व्यवहार्यता के लिए हानिकारक हो सकता है, कोबायाशी एट al.16 द्वारा एक 2007 प्रकाशन ने प्रदर्शित किया कि 5 minues से परे sonication समय में वृद्धि हुई है जिसके परिणामस्वरूप व्यवहार्य प्लेट की गिनती में कमी आई है। चूंकि हमारे अध्ययन में कुल 1 मिनट का sonication का उपयोग किया गया था, इसलिए हमें विश्वास है कि कुछ कोशिकाओं को sonication के माध्यम से मार दिया गया था जैसा कि दो sonication पैरामीटर के लिए >9.2 LOG10 CFU / कूपन द्वारा दिखाया गया है। यह दिलचस्प है कि सतह से बायोफिल्म की पूरी फसल किसी भी विधि द्वारा प्राप्त नहीं की गई थी। यह खोज दर्शाती है कि अकेले व्यवहार्य प्लेट की गिनती कटाई और भेदभाव पूर्वाग्रह को निर्धारित करने के लिए पर्याप्त नहीं है और इसलिए इसे एक अतिरिक्त विधि, माइक्रोस्कोपी के साथ जोड़ा जाना चाहिए, उदाहरण के लिए।
sonicator सेटिंग्स के अलावा, हम sonication को प्रभावित करने वाले अन्य महत्वपूर्ण कारकों की जांच की। इनमें शीशियों (10 या 40 मिलीलीटर) में तरल की मात्रा, शीशी में तरल का प्रकार (बफर किए गए पानी या 2एक्स डी / ई न्यूट्रलाइज़िंग शोरबा) और एक ही समय में स्नान में रखी गई शीशियों की संख्या (3 या 12 शीशियां) 9 शामिल थीं।
सीडीसी बायोफिल्म रिएक्टर कूपन पर पी एरुगिनोसा बायोफिल्म्स को सोनिकेटर सेटिंग 2 (45 kHz, 100% शक्ति, सामान्य सेटिंग, 30 ± 5 सेकंड) का उपयोग करके sonicated किया गया था। सभी नमूनों को एक समय में या तो 3 या एक समय में 6 का उपयोग करके एक 6-स्थान ट्यूब अनुलग्नक के साथ फिट किए गए भंवर का उपयोग करके भंवर किया गया था, फिर चित्रा 3 में वर्णित के रूप में sonicated। निम्नलिखित श्रेणियों में से प्रत्येक से एक कूपन सीएम (चित्रा 3) का उपयोग करके चित्रित किया गया था।
दूसरे अध्ययन में जहां sonication मापदंडों की जांच की गई थी, माइक्रोस्कोपिक छवियों (चित्रा 3) का सुझाव है कि ट्यूबों में मात्रा को कम करने, एक बार में संसाधित ट्यूबों की संख्या को कम करने और डी / ई न्यूट्रलाइज़िंग शोरबा (जिसमें surfactant शामिल है) का उपयोग सभी कूपन से बढ़ी हुई बायोफिल्म कटाई में योगदान करते हैं।
बायोसाइड्स सकारात्मक या नकारात्मक रूप से कटाई और भेदभाव को बढ़ा सकते हैं। यह पुष्टि करने के समान कि एक न्यूट्रलाइज़र प्रभावी रूप से सक्रिय को रोकता है, जबकि प्रभावकारिता परीक्षण करने से पहले हत्या में वृद्धि नहीं करता है, यह पुष्टि करना महत्वपूर्ण है कि एक बायोसाइड कटाई और भेदभाव को अलग-अलग प्रभावित नहीं करता है। प्रभावकारिता परीक्षण के लिए, पूर्वाग्रह परिणाम यदि और केवल अगर नियंत्रण बनाम इलाज biofilm नमूने 11 के लिए अंतर हटाने है।
चित्रा 1: क्रिस्टल बैंगनी अवशिष्ट biofilm का प्रदर्शन के साथ दाग कूपन की तस्वीरें. ए) कूपन रिएक्टर से हटा दिया और क्रिस्टल बैंगनी के साथ दाग. बी, सी, डी) तीन प्रतिकृति कूपन को अलग-अलग बाँझ बफ़र्ड पानी के साथ "इलाज" किया गया था, फिर बेअसर कर दिया गया था। फसल और disaggregate करने के लिए, कूपन vortexed (30 ± 5 सेकंड) और sonicated (45 kHz, 10% शक्ति, स्वीप सेटिंग, 30 ± 5 सेकंड) दो बार तो एक अंतिम भंवर प्राप्त किया गया. डेनिएल ऑरर और ब्लेन फ्रिट्ज के सौजन्य से छवियां। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: दो अलग-अलग sonication सेटिंग्स की तुलना कूपन के Confocal माइक्रोस्कोपी छवियों. कूपन (12.5X आवर्धन) sonication सेटिंग के माध्यम से संसाधित 1 (45 kHz, 10% शक्ति, स्वीप सेटिंग) बाईं ओर या sonication सेटिंग 2 (45 kHz, 100% शक्ति, सामान्य सेटिंग) दाईं ओर. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3. कूपन की confocal माइक्रोस्कोपी मात्रा, sonication तरल और ट्यूबों की संख्या की तुलना छवियों. कूपन (12.5X आवर्धन) 10 या 40 मिलीलीटर मात्रा में संसाधित, कमजोर पड़ने वाले पानी (डीडब्ल्यू) या डी / ई न्यूट्रलाइज़िंग शोरबा (डी / ई), अनुकूलित sonication सेटिंग (45 kHz, 100% शक्ति, सामान्य सेटिंग) के साथ एक समय में 3 या 12 ट्यूबों में संसाधित। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
अनुपूरक फ़ाइल 1: कटाई और भेदभाव के लिए महत्व के प्रमुख पैरामीटर कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
कटाई और विभेदन विधियों के लिए न्यूनतम जानकारी
वैज्ञानिक समुदाय में पुनरुत्पादक बायोफिल्म डेटा बनाने के लिए, यह आवश्यक है कि लेखकों को बायोफिल्म विधि के विकास, उपचार, नमूनाकरण और विश्लेषण चरणों में से प्रत्येक के बारे में जितना संभव हो उतना विवरण शामिल हो। बायोफिल्म विधियों के मानकीकरण ने इस प्रयास में सहायता की है क्योंकि यह शोधकर्ता को एक विशिष्ट विधि और किसी भी प्रासंगिक संशोधनों को संदर्भित करने की अनुमति देता है। हालांकि, कई पत्रों में बायोफिल्म हार्वेस्टिंग और भेदभाव का वर्णन करने के लिए केवल एक वाक्य या दो शामिल हैं। बेहतर पुनरुत्पादन के लिए, हम अनुशंसा करते हैं कि बायोफिल्म कटाई के लिए न्यूनतम जानकारी को प्रकाशनों में शामिल किया जाए। यह Lourenco et al.17 द्वारा प्रस्तुत एक Biofilm प्रयोग (MIABiE) पहल के बारे में न्यूनतम जानकारी पर बनाता है। बायोफिल्म कटाई और विभेदन मापदंडों के लिए sonication का उपयोग करने के मामले में जानकारी शामिल होना चाहिए: स्नान के भीतर ट्यूबों की स्थिति (निर्माताओं की सिफारिशों को ट्रांसड्यूसर को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए), एक ही समय में sonicated ट्यूबों की संख्या, ट्यूब सामग्री, मात्रा और ट्यूब में तरल के प्रकार, surfactant की उपस्थिति, अल्ट्रासोनिक स्नान के तरल स्तर के सापेक्ष ट्यूबों में तरल की स्थिति, डिवाइस स्नान में ट्यूबों को पकड़ने के लिए इस्तेमाल किया (ग्लास बीकर बनाम टेस्ट ट्यूब रैक), नमूनों के sonication से पहले पानी के स्नान के degassing (यदि degassing एक निर्माता विकल्प नहीं है, तो नमूने डालने से पहले स्नान के सरल संचालन स्नान तरल से कुछ भंग gasses को हटाने में मदद मिलेगी), पानी के स्नान का तापमान (sonication की लंबी अवधि के बाद तापमान बढ़ सकता है), आवृत्ति (25 kHz या 45 kHz, उदाहरण के लिए), स्नान समारोह (उदाहरण के लिए, स्वीप या सामान्य) और पावर रेंज transducers (10 - 100%, उदाहरण के लिए) को वितरित किया। इन सेटिंग्स biofilm अध्ययन किया जा रहा है के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए, सिस्टम biofilm और अल्ट्रासोनिक bath18 के विशिष्ट बनाने /
Sonicator सेटिंग्स वांछित कटाई प्रभाव ों को अनुकूलित करने के लिए परिवर्तित किया जा सकता है। Degassing स्नान तरल के भीतर भंग हवा को हटा देता है जिससे सफाई की शक्ति बढ़ जाती है। आवृत्ति को कम या उच्च सेटिंग में समायोजित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, 25 kHz जैसी कम सेटिंग, दृढ़ नमूनों की कटाई में सहायता करेगी, जबकि 45 kHz की उच्च सेटिंग संवेदनशील नमूनों के लिए अधिक उपयुक्त होगी। स्वीप या सामान्य का एक स्नान समारोह cavitation के वितरण के लिए अनुमति देता है। स्वीप फ़ंक्शन ध्वनि दबाव maxima का एक निरंतर स्थानांतरण बनाता है। सामान्य फ़ंक्शन ट्रांसड्यूसर को डबल हाफ वेव मोड में संचालित करने की अनुमति देता है जिसके परिणामस्वरूप मृत क्षेत्र हो सकते हैं, जिससे sonication कम प्रभावी हो सकता है। पावर रेंज को ट्रांसड्यूसर 19 को दी गई शक्ति के 10 - 100% से बदला जा सकता है। यह ज्ञात है कि sonication हानिकारक जीवाणु व्यवहार्यता को प्रभावित कर सकते हैं. Stamper et al.20 द्वारा एक 2008 के अध्ययन ने बैक्टीरिया संस्कृतियों को समय के साथ अल्ट्रासोनिक ऊर्जा बढ़ाने के लिए उजागर किया ताकि बैक्टीरिया को मारने के घटता बनाया जा सके। हम अनुशंसा करते हैं कि उपयोगकर्ताओं की पुष्टि करें कि sonication सेटिंग्स का एक विशेष संयोजन व्यवहार्य बैक्टीरिया 20 में कमी का कारण नहीं बनता है।
बायोफिल्म को काटने और अलग करने के लिए कोई एक सही तरीका नहीं है, लेकिन विशेष तरीके दूसरों की तुलना में कुछ सतहों / माइक्रोब संयोजनों के लिए बेहतर काम करते हैं। हम पाठक के लिए यह निर्धारित करने की वकालत करते हैं कि उनके विशेष बायोफिल्म परिदृश्य के लिए कौन से पैरामीटर महत्वपूर्ण हैं। कटाई और विभेदन के लिए महत्व के प्रमुख पैरामीटर अनुपूरक फ़ाइल 1 में शामिल हैं।
कटाई और भेदभाव पूर्वाग्रह का आकलन करने के लिए किए गए sonication अध्ययनों के लिए, हमने पाया कि sonication सुविधाजनक, कुशल और कटाई के लिए मानकीकृत किया जा करने में सक्षम है और सतहों से biofilm disaggregating. शीशियों में कूपन का प्लेसमेंट तकनीशियन परिवर्तनशीलता के लिए तकनीशियन को कम करता है जो उन तरीकों में सामना किया जाएगा जहां कूपन को प्रयोगशाला कर्मियों द्वारा शारीरिक रूप से स्क्रैप किया जाता है, उदाहरण के लिए। यद्यपि यह एक sonicating पानी के स्नान में शीशियों जगह करने के लिए काफी सरल लगता है, वहाँ कई मापदंडों है कि biofilm के इष्टतम कटाई को प्राप्त करने के लिए विचार किया जा करने की जरूरत है.
sonication उपकरण के दो प्रकार उपलब्ध हैं, अल्ट्रासोनिक स्नान और अल्ट्रासोनिक जांच। यह पेपर मुख्य रूप से अल्ट्रासोनिक स्नान पर केंद्रित है जहां अल्ट्रासोनिक ऊर्जा सामान्य (40 - 60 हर्ट्ज) आवृत्ति के लिए उच्च (20 - 45 kHz) की सीमा में उत्पन्न होती है।
एक सतह को साफ करने के लिए एक अल्ट्रासोनिक डिवाइस का उपयोग करते समय तीन मुख्य प्रक्रियाएं खेल में हैं। विद्युत ऊर्जा को ध्वनिक ऊर्जा में परिवर्तित किया जाता है जब एक उच्च आवृत्ति वर्तमान को एक पीजोइलेक्ट्रिक या मैग्नेटोस्ट्रिक्टिव ट्रांसड्यूसर में भेजा जाता है जो वर्तमान के जवाब में दोलन करता है। दोलन तरल में संपीड़न (दुर्लभता) तरंगों को उत्पन्न करता है। विरलता के दौरान नकारात्मक दबाव के कारण cavitation बुलबुले फार्म. बुलबुले तब तक बढ़ते हैं जब तक कि वे एक अस्थिर आकार तक नहीं पहुंच जाते हैं और ढह जाते हैं, जिससे एक पानी का जेट बनता है जो सतहों को साफ करता है21।
इस लेख में तीन कटाई और भेदभाव दृष्टिकोण का प्रदर्शन किया गया है: एकल ट्यूब विधि के अनुसार सीडीसी बायोफिल्म रिएक्टर में पॉली कार्बोनेट कूपन पर उगाए जाने पर कटाई और बायोफिल्म को अलग करने के लिए sonication और vortexing विधियों। स्क्रैपिंग और homogenization की कटाई और disaggregating biofilm के लिए विधियों को दिखाया जाता है जब ड्रिप फ्लो बायोफिल्म रिएक्टर का उपयोग करके ग्लास कूपन पर उगाया जाता है। स्क्रैपिंग, sonication और कटाई और disaggregating biofilm के लिए vortexing विधियों को दिखाया जाता है जब सिलिकॉन टयूबिंग में उगाया जाता है।
बायोफिल्म को काटने और अलग करने का कोई सही तरीका नहीं है, लेकिन कुछ दृष्टिकोण विभिन्न सतहों और / या अनुप्रयोगों के लिए बेहतर हैं। महत्वपूर्ण बात यह है कि उपयोग की जाने वाली विधि को मान्य करने के लिए समय निकालें। इस पेपर में, हमने क्रिस्टल वायलेट और माइक्रोस्कोपी के उपयोग पर चर्चा की, लेकिन आवश्यक संवेदनशीलता के आधार पर अन्य विकल्प मौजूद हैं। यदि अनुसंधान में प्रभावकारिता परीक्षण शामिल है, तो रोगाणुरोधी 6 की उपस्थिति में दृष्टिकोण की वैधता की पुष्टि करना महत्वपूर्ण है। सभी उपकरण थोड़ा अलग हैं, इसलिए भले ही कटाई और भेदभाव विधि को मानकीकृत किया गया हो, फिर भी उपयोग किए जाने वाले उपकरणों के लिए प्रक्रिया की पुष्टि करना विवेकपूर्ण है। कटाई और विभेदन विधियां सतह से जुड़े और बायोफिल्म बैक्टीरिया के लिए विशिष्ट हैं। अनुसंधान ने दिखाया है कि अनुचित विकल्प पक्षपातपूर्ण परीक्षण परिणामों को जन्म दे सकते हैं। फिर भी, कटाई और भेदभाव बायोफिल्म विधियों में चार चरणों में से कम से कम अध्ययन किया जाता है। यह आम तौर पर भी अवांछित कदम है (काम के रूप में दी गई) प्रकाशित पेपर में मौजूद कम से कम जानकारी के साथ एक अलग प्रयोगशाला में प्रक्रिया को पुन: पेश करना चुनौतीपूर्ण बनाता है। यह पेपर और साथ के वीडियो दो सतह प्रकारों के लिए तीन सामान्य दृष्टिकोण दिखाते हैं और सुझाव देते हैं कि एक व्यक्तिगत प्रयोगशाला के लिए एक विधि को कैसे मान्य किया जाए। यह जानकारी शोधकर्ताओं को किस विधि का उपयोग करने के बारे में अधिक सूचित निर्णय लेने में मदद करेगी और पुनरुत्पादन में सुधार के लिए क्या रिपोर्ट करना है, इस पर मार्गदर्शन प्रदान करती है।
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Disclosures
लेखकों के पास कोई खुलासा नहीं है।
Acknowledgments
हम इस पेपर में उनके योगदान के लिए डैनियल ऑर गोविया, ब्लेन फ्रिट्ज, जेनिफर समर्स और फेई सैन ली को स्वीकार करना चाहते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL conical vials | Thermo Scientific | 339652 | |
| 100 mL glass beakers | Fisher Scientific | FB102100 | |
| 5 mL serological pipettes | Fisher Scientific | 13-678-12D | For adding treatment to vials containing coupons. |
| 50 mL serological pipettes | Fisher Scientific | 13-678-14C | For adding neutralizer to vials at the end of treatment contact time. |
| Applicator sticks | Puritan | 807 | |
| Hemostats | Fisher Scientific | 16-100-115 | |
| Metal spatula | Fisher Scientific | 14-373 | |
| PTFE policemen | Saint-Gobain | 06369-04 | |
| S 10 N - 10 G - ST Dispersing tool | IKA | 4446700 | For homogenization of biofilm samples. |
| Scissors | Fisher Scientific | 08-951-20 | |
| Silicone Foley catheter, size 16 French | Medline Industries | DYND11502 | |
| Silicone tubing, size 16 | Cole-Parmer | EW96400-16 | |
| Splash Guards | BioSurface Technologies, Inc. | CBR 2232 | |
| T 10 basic ULTRA-TURRAX Disperser | IKA | 3737001 | For homogenization of biofilm samples. |
| Tubing connectors | Cole-Parmer | EW02023-86 | |
| Ultrasonic Cleaner | Elma | TI-H15 | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Vortex-Genie 2 Vertical 50 mL Tube Holder | Scientific Industries | SI-V506 |
References
- Donlan, R. M. Biofilms: microbial life on surfaces. Emerging Infectious Diseases. 8 (9), 881-890 (2002).
- ASTM International. ASTM Standard E2562, 2017, Standard Test Method for Quantification of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Grown with High Shear and Continuous Flow using CDC Biofilm Reactor. ASTM International. , West Conshohocken, PA. (2017).
- Environmental Protection Agency (USEPA). Efficacy Test Methods, Test Criteria, and Labeling Guidance for Antimicrobial Products with Claims Against Biofilm on Hard, Non-Porous Surfaces. Environmental Protection Agency (USEPA). , Available from: http://www.epa.gov/perticide-analytical-methods/efficacy-test-methods-test-criteria-and-labeling-guidance-antimicrobial (2021).
- Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews In Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).
- Gomes, I. B., et al. Standardized reactors for the study of medical biofilms: a review of the principles and latest modifications. Critical Reviews in Biotechnology. 38 (5), 657-670 (2018).
- Goeres, D. M., et al. Design and fabrication of biofilm reactors. Recent Trends in Biofilm Sciences and Technology. Simoes, M., et al. , Elsevier Science and Technology. 71-88 (2020).
- Goeres, D. M., et al. A method for growing a biofilm under low shear at the air-liquid interface using the drip flow biofilm reactor. Nature Protocols. 4 (5), 783-788 (2009).
- ASTM International. ASTM Standard E2871, Standard Test Method for Determining Disinfectant Efficacy Against Biofilm Grown in the CDC Biofilm Reactor Using the Single Tube Method. ASTM International. , West Conshohocken, PA. (2019).
- Goeres, D. M., et al. Validation of a Biofilm Efficacy Test: The Single Tube Method. Journal of Microbiological Methods. , (2019).
- Summers, J. G. The development and validation of a standard in vitro method to evaluate the efficacy of surface modified urinary catheters. Theses and Dissertations at Montana State University. , Available from: https://scholarworks.montana.edu/xmlui/handle/1/15149 (2019).
- Hamilton, M. A., Buckingham-Meyer, K., Goeres, D. M. Checking the Validity of the harvesting and Disaggregating Steps in Laboratory Tests of Surface Disinfectants. Journal of AOAC International. 92 (6), 1755-1762 (2009).
- Conlon, B. P., Rowe, S. E., Lewis, K. Persister Cells in Biofilm Associated Infections. Biofilm-based Healthcare-associated Infections. Donelli, G. , (2015).
- ASTM International. ASTM Standard E2647, Standard Test Method for Quantification of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Grown Using Drip Flow Biofilm Reactor with Low Shear and Continuous Flow. ASTM International. , West Conshohocken, PA. (2020).
- Rosenberg, M., Azevedo, N., Ivask, A. Propidium iodide staining underestimates viability of adherent bacterial cells. Scientific Reports. , (2019).
- Stiefel, P., Schmidt-Emrich, S., Manuira-Weber, K., Ren, Q. Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide. BMC Microbiology. , (2015).
- Kobayashi, N., Bauer, T. W., Tuohy, M. J., Fujishiro, T., Procop, G. W. Brief Ultrasonication Improves Detection of Biofilm-formative Bacteria Around a Metal Implant. Clinical Orthopaedics and Related Research. 457, 210-213 (2007).
- Lourenco, A., et al. Minimum information about a biofilm experiment (MIABiE), standards for reporting experiments and data on sessile microbial communities living at interfaces. Pathogens and Disease. 0, 1-7 (2014).
- Nascentes, C. C., Korn, M., Sousa, C. S., Arruda, M. A. Z. Use of Ultrasonic Baths for Analytical Applications: A New Approach for Optimisation Conditions. Journal of Brazilian Chemical Society. 12 (1), 57-63 (2001).
- Elma GmbH & Co. KG TI-H Ultrasonic Cleaning Units: Operating Instructions. Elma GmbH & Co. , Singen, Germany. (2009).
- Stamper, D. M., Holm, E. R., Brizzolara, R. A. Exposure times and energy densities for ultrasonic disinfection of Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus avium and sewage. Journal of Environmental Engineering and Science. 7 (2), 139-146 (2008).
- Suslick, K. S.
