Høsting og disaggregation: Et oversett skritt i biofilmmetoder Forskning
Summary
Dette dokumentet beskriver metoder som demonstrerer tre vanlige biofilmhøstings- og disaggregeringsteknikker på to overflatetyper, robusthetstesting av en høstingsmetode og minimumsinformasjon å vurdere når du velger og optimaliserer høstings- og disaggregatasjonsteknikker for å øke reproduserbarheten.
Abstract
Biofilmmetoder består av fire forskjellige trinn: å dyrke biofilmen i en relevant modell, behandle den modne biofilmen, høste biofilmen fra overflaten og dele opp klumpene og analysere prøven. Av de fire trinnene er høsting og disaggregering minst studert, men likevel kritisk når man vurderer potensialet for testbias. Denne artikkelen demonstrerer ofte brukte høstings- og disaggregeringsteknikker for biofilm dyrket på tre forskjellige overflater. De tre biofilmhøstings- og disaggregatasjonsteknikkene, hentet fra en omfattende litteraturgjennomgang, inkluderer virvel- og sonikering, skraping og homogenisering, og skraping, virveling og sonikering. To overflatetyper vurderes: hard ikke-porøs (polykarbonat og borosilikatglass) og porøst (silikon). I tillegg gir vi anbefalinger for minimumsinformasjonen som bør inkluderes når du rapporterer høstingsteknikken som følges og en tilhørende metode for å se etter skjevheter.
Introduction
Definisjonen av biofilm har utviklet seg de siste tiårene og omfatter mikrobiell tilknytning til en rekke biologiske og/eller ikke-biologiske overflater, inkludering av ikke-cellulære komponenter1 som viser forskjellig vekst og genetisk uttrykk2 i en matrise. Biofilm gir beskyttelse mot miljøbelastninger som tørking og kan gjøre virkningen av kjemiske desinfeksjonsmidler mindre effektiv, noe som resulterer i overlevelse av mikrober. De overlevende i en biofilm kan potensielt gi en kilde til patogene mikroorganismer som er et folkehelseproblem3.
Biofilmmetoder består av fire trinn, vekst, behandling, prøvetaking (høsting og disaggregering) og analyse. Vekst, det første trinnet, hvor brukeren bestemmer organismens vekstforhold, temperatur, media, etc., er det mest gjennomtenkte og rapporterte i biofilmlitteraturen4,5,6,7. Behandlingstrinnet evaluerer antimikrobielle midler (f.eks. desinfeksjonsmidler) for å bestemme effekten enten mot en moden biofilm3,8,9 eller den antimikrobielle kan innlemmes i overflaten for å bestemme produktets evne til å forhindre eller redusere biofilmvekst10. Det tredje trinnet, prøvetaking, inkluderer trinn for å høste biofilmen fra overflaten den vokste på og for å disaggregatere de fjernede klumpene3,8,11. Det fjerde trinnet, analyse, kan omfatte levedyktige celletall, mikroskopi, fluorescensmålinger, molekylære resultater og/eller en matrisekomponentvurdering8,9. Vurdering av data gir informasjon om utfallet av et eksperiment. Av de fire er prøvetaking ofte det mest oversett trinnet fordi det forutsetter at den valgte biofilmhøstings- og / eller disaggregeringsteknikken er 100% effektiv, ofte uten verifisering11.
Planktoniske suspensjoner av bakterier, ofte ansett for å være homogene, krever enkel virveling før analyse. Biofilmer er imidlertid komplekse samfunn som består av mikroorganismer (prokaryote og/eller eukaryote), eksopolysakkarider, proteiner, lipider, ekstracellulært DNA og vertsceller12. Trinn utover tradisjonelle planktoniske mikrobiologiske kulturmetoder er nødvendig for å tilstrekkelig høste biofilm fra en overflate og deretter dele den opp i en homogen encellet suspensjon. En omfattende litteraturgjennomgang (informasjon som ikke er inkludert i denne publikasjonen) viste at valget av fjernings- og de aggregeringsteknikk er avhengig av en rekke faktorer, inkludert arter som er tilstede i biofilmen, overflaten som biofilmen er festet til (ikke-porøs eller porøs), tilgjengelighet til vekstflater (lett avtagbar kupong eller fysisk ødeleggelse av apparater der biofilmen vokser), overflategeometri (areal og form), tetthet av biofilm på vekstflater og tilgjengelig laboratorieutstyr.
Når biofilm høstes fra en overflate, er den resulterende cellefjæringen heterogen. Hvis denne ikke-enhetlige suspensjonen skal nummereres nøyaktig, må den deles opp i enkeltceller. Levedyktige platetall antar at en kolonidannende enhet stammer fra en bakterie. Hvis aggregater av biofilm plasseres på vekstmediet, er det umulig å skille mellom individuelle celler som kan føre til unøyaktige estimater. For eksempel, under desinfiserende effekttesting, hvis en behandling fjerner biofilm veldig effektivt fra en overflate sammenlignet med kontrollen, kan loggreduksjonen virke kunstig stor sammenlignet med kontrollen. På den annen side vil et kjemisk desinfeksjonsmiddel som fikser biofilm på en overflate sammenlignet med kontrollen, se ut til å ha en lavere loggreduksjon11. Denne typen scenario kan føre til partisk tolkning av eksperimentelle data.
Som forberedelse til publikasjonen fastslo en gjennomgang av litteraturen at vanlige tilnærminger til høsting og deaggregating av biofilm inkluderer skraping, swabbing, sonikering, virveling eller en kombinasjon av disse. Skraping er definert som fysisk fjerning av biofilm fra overflater med en steril pinne, spatel eller annet verktøy. Swabbing refererer til fjerning av biofilm fra overflater med en bomullspinne eller annet fast absorberende materiale. Sonikering refererer til forstyrrelse av biofilm fra overflater via ultralydbølger fordelt gjennom vann. Vortexing refererer til bruk av en mikser for å oppnå en flytende virvel av prøven inne i et rør. Homogenisering bruker roterende kniver for å skjære høstede biofilmklumper inn i en enkelt cellefjæring. I dette dokumentet presenterer vi tre høstings- og disaggregatasjonsmetoder for to forskjellige overflatetyper, harde/ikke-porøse og porøse.
Det gis en liste over anbefalt minimumsinformasjon som forskeren bør inkludere i metodedelene i publikasjoner. Vi håper at inkludering av denne informasjonen gjør det mulig for andre forskere å reprodusere sitt arbeid. Det er ingen perfekt høstings- og disaggregeringsmetode, derfor er anbefalinger for hvordan du sjekker teknikken også gitt.
Tre vanlige metoder for å høste og disaggregate biofilm fra vanlige vekstflater er demonstrert i denne artikkelen. Denne informasjonen vil gjøre det mulig for forskere å bedre forstå den generelle presisjonen og skjevheten i en biofilmtestmetode. Metoder beskrevet er som følger: (1) En Pseudomonas aeruginosa biofilm dyrket på polykarbonatkuponger (hard ikke-porøs overflate) under høy væskeskjær i CDC Biofilm Reactor høstes og oppløses etter en femtrinns kombinasjon av virveling og sonikering for å oppnå biofilmhøsting og disaggregation (2) A P. aeruginosa biofilm dyrket på borosilikatglasskuponger (hard ikke-porøs overflate) i dryppstrømreaktoren under lav væskeskjær høstes og demonteres ved hjelp av skraping og homogenisering (3) En Escherichia coli biofilm dyrket i silikonrør (porøs overflate) høstes og deaggregateres ved hjelp av skraping, etterfulgt av sonikering og vortexing.
Protocol
Representative Results
Discussion
Minimumsinformasjon for innhøstings- og de aggregeringsmetoder
For å lage reproduserbare biofilmdata på tvers av det vitenskapelige samfunnet, er det viktig at forfattere inkluderer så mange detaljer som mulig angående hver av vekst-, behandlings-, prøvetakings- og analysetrinnene i en biofilmmetode. Standardiseringen av biofilmmetoder har bidratt i dette arbeidet, da det gjør det mulig for forskeren å referere til en bestemt metode og eventuelle relevante modifikasjoner. Imidlertid inkluderer…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi ønsker å anerkjenne Danielle Orr Goveia, Blaine Fritz, Jennifer Summers og Fei San Lee for deres bidrag til denne avisen.
Materials
| 50 mL conical vials | Thermo Scientific | 339652 | |
| 100 mL glass beakers | Fisher Scientific | FB102100 | |
| 5 mL serological pipettes | Fisher Scientific | 13-678-12D | For adding treatment to vials containing coupons. |
| 50 mL serological pipettes | Fisher Scientific | 13-678-14C | For adding neutralizer to vials at the end of treatment contact time. |
| Applicator sticks | Puritan | 807 | |
| Hemostats | Fisher Scientific | 16-100-115 | |
| Metal spatula | Fisher Scientific | 14-373 | |
| PTFE policemen | Saint-Gobain | 06369-04 | |
| S 10 N – 10 G – ST Dispersing tool | IKA | 4446700 | For homogenization of biofilm samples. |
| Scissors | Fisher Scientific | 08-951-20 | |
| Silicone Foley catheter, size 16 French | Medline Industries | DYND11502 | |
| Silicone tubing, size 16 | Cole-Parmer | EW96400-16 | |
| Splash Guards | BioSurface Technologies, Inc. | CBR 2232 | |
| T 10 basic ULTRA-TURRAX Disperser | IKA | 3737001 | For homogenization of biofilm samples. |
| Tubing connectors | Cole-Parmer | EW02023-86 | |
| Ultrasonic Cleaner | Elma | TI-H15 | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Vortex-Genie 2 Vertical 50 mL Tube Holder | Scientific Industries | SI-V506 |
References
- Donlan, R. M. Biofilms: microbial life on surfaces. Emerging Infectious Diseases. 8 (9), 881-890 (2002).
- ASTM International. ASTM Standard E2562, 2017, Standard Test Method for Quantification of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Grown with High Shear and Continuous Flow using CDC Biofilm Reactor. ASTM International. , (2017).
- Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews In Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).
- Gomes, I. B., et al. Standardized reactors for the study of medical biofilms: a review of the principles and latest modifications. Critical Reviews in Biotechnology. 38 (5), 657-670 (2018).
- Goeres, D. M., et al., Simoes, M., et al. Design and fabrication of biofilm reactors. Recent Trends in Biofilm Sciences and Technology. , 71-88 (2020).
- Goeres, D. M., et al. A method for growing a biofilm under low shear at the air-liquid interface using the drip flow biofilm reactor. Nature Protocols. 4 (5), 783-788 (2009).
- ASTM International. ASTM Standard E2871, Standard Test Method for Determining Disinfectant Efficacy Against Biofilm Grown in the CDC Biofilm Reactor Using the Single Tube Method. ASTM International. , (2019).
- Goeres, D. M., et al. Validation of a Biofilm Efficacy Test: The Single Tube Method. Journal of Microbiological Methods. , (2019).
- The development and validation of a standard in vitro method to evaluate the efficacy of surface modified urinary catheters. Theses and Dissertations at Montana State University Available from: https://scholarworks.montana.edu/xmlui/handle/1/15149 (2019)
- Hamilton, M. A., Buckingham-Meyer, K., Goeres, D. M. Checking the Validity of the harvesting and Disaggregating Steps in Laboratory Tests of Surface Disinfectants. Journal of AOAC International. 92 (6), 1755-1762 (2009).
- Conlon, B. P., Rowe, S. E., Lewis, K., Donelli, G. Persister Cells in Biofilm Associated Infections. Biofilm-based Healthcare-associated Infections. , (2015).
- ASTM International. ASTM Standard E2647, Standard Test Method for Quantification of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Grown Using Drip Flow Biofilm Reactor with Low Shear and Continuous Flow. ASTM International. , (2020).
- Rosenberg, M., Azevedo, N., Ivask, A. Propidium iodide staining underestimates viability of adherent bacterial cells. Scientific Reports. , (2019).
- Stiefel, P., Schmidt-Emrich, S., Manuira-Weber, K., Ren, Q. Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide. BMC Microbiology. , (2015).
- Kobayashi, N., Bauer, T. W., Tuohy, M. J., Fujishiro, T., Procop, G. W. Brief Ultrasonication Improves Detection of Biofilm-formative Bacteria Around a Metal Implant. Clinical Orthopaedics and Related Research. 457, 210-213 (2007).
- Lourenco, A., et al. Minimum information about a biofilm experiment (MIABiE), standards for reporting experiments and data on sessile microbial communities living at interfaces. Pathogens and Disease. , 1-7 (2014).
- Nascentes, C. C., Korn, M., Sousa, C. S., Arruda, M. A. Z. Use of Ultrasonic Baths for Analytical Applications: A New Approach for Optimisation Conditions. Journal of Brazilian Chemical Society. 12 (1), 57-63 (2001).
- Elma GmbH & Co. KG TI-H Ultrasonic Cleaning Units: Operating Instructions. Elma GmbH & Co. , (2009).
- Stamper, D. M., Holm, E. R., Brizzolara, R. A. Exposure times and energy densities for ultrasonic disinfection of Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus avium and sewage. Journal of Environmental Engineering and Science. 7 (2), 139-146 (2008).
- Suslick, K. S. Sonochemistry. Science. 247 (4949), (1990).
