Establecimiento y manipulación genética de organoides hepatocitos murinos

Summary

Se estableció un sistema de cultivo de organoides 3D ex vitro a largo plazo a partir de hepatocitos de ratón. Estos organoides pueden ser atravesados y manipulados genéticamente por infección por lentivirus de construcción shRNA/ectópica, transfección de siRNA e ingeniería CRISPR-Cas9.

Abstract

El hígado es el órgano más grande en los mamíferos. Juega un papel importante en el almacenamiento de glucosa, la secreción de proteínas, el metabolismo y la desintoxicación. Como ejecutor de la mayoría de las funciones hepáticas, los hepatocitos primarios tienen una capacidad de proliferación limitada. Esto requiere el establecimiento de modelos de expansión de hepatocitos ex vivo para la investigación fisiológica y patológica del hígado. Aquí, aislamos los hepatocitos murinos por dos pasos de perfusión de colagenasa y establecimos un cultivo de organoides 3D como el “mini-hígado” para recapitular las interacciones célula-célula y las funciones físicas. Los organoides consisten en poblaciones celulares heterogéneas que incluyen progenitores y hepatocitos maduros. Introducimos el proceso en detalle para aislar y cultivar los hepatocitos murinos o el hepatocito fetal para formar organoides en 2-3 semanas y mostrar cómo pasarlos canalizando mecánicamente hacia arriba y hacia abajo. Además, también presentaremos cómo digerir los organoides en células individuales para la infección por lentivirus de la construcción shRNA / ectópica, la transfección de siRNA y la ingeniería CRISPR-Cas9. Los organoides se pueden utilizar para pruebas de detección de drogas, modelado de enfermedades e investigación hepática básica mediante el modelado de la biología hepática y la patobiología.

Introduction

Los organoides son grupos in vitro autoorganizados, tridimensionales (3D) que incluyen células madre autorrenovantes y células diferenciadas ^{multilinaje1,2}. Los organoides de muchos órganos se han establecido a partir de células madre pluripotentes o adultas por factores de nicho bien definidos, incluidos el intestino, el cerebro, el colon, el riñón, el hígado, el páncreas, la tiroides, el estómago, la piel y el pulmón3,4,5,6,7 . Los organoides recapitulan las funciones de las células físicas imitando el desarrollo (originado a partir de células madre pluripotentes embrionarias o inducidas, PSC) o la progresión de la homeostasis/regeneración (originada a partir de células madre adultas, ASC), lo que abre nuevas vías en la investigación y terapia de ^{enfermedades8,9}.

Como el órgano más grande en los mamíferos, el hígado es principalmente responsable del almacenamiento, el metabolismo y la desintoxicación. Dos tipos de tipos de células epiteliales, los hepatocitos y los colangiocitos, construyen la unidad básica de un lóbulo hepático. Los hepatocitos son responsables del 70-80% de la función ^hepática10. Aunque el hígado tiene una notable capacidad de regeneración, la rápida pérdida de las características de los hepatocitos ocurre durante el cultivo monocapa tradicional por polarización y desdiferenciación celular desregulada, lo que aumenta la necesidad de investigadores y médicos de construir modelos hepáticos de “puente de brecha” en un plato. Sin embargo, hasta hace poco los modelos de expansión ex vivo de los hepatocitos primarios no estaban bien establecidos11,12,13,14,15. Los organoides hepáticos se pueden establecer a partir de células madre pluripotentes embrionarias / inducidas, conversión de fibroblastos en células similares a hepatocitos y células derivadas de tejidos. El desarrollo de organoides hepáticos impulsa la aplicación de un modelo in vitro para cribados farmacológicos y ensayos de toxicidad ^{hepática16,17}.

Aquí, describimos un protocolo detallado para establecer organoides hepáticos a partir de hepatocitos primarios murinos. Mediante el uso de este protocolo, establecimos un sistema de cultivo in vitro de organoides de hepatocitos con dos perfusiones de colagenasa. Estos organoides pueden ser pasados para la expansión a largo plazo durante meses. Su función fisiológica es altamente consistente con los hepatocitos. Además, también proporcionamos una descripción detallada de cómo realizar la manipulación genética, como la infección por lentivirus, la transducción de siRNA y la ingeniería CRISPR-Cas9 utilizando organoides. La propagación de organoides de hepatocitos arrojó luz sobre la posibilidad de utilizar organoides para comprender la biología hepática y desarrollar enfoques de medicina personalizados y traslacionales.

Protocol

Todos los experimentos con ratones fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Escuela de Ciencias Médicas Básicas de la Universidad de Shandong y se llevaron a cabo de acuerdo con la Licencia bajo las pautas y regulaciones del Ministerio del Interior (No. ECSBMSSDU2019-2-079). NOTA: Este protocolo se utiliza principalmente para cultivar organoides 3D a partir de hepatocitos primarios aislados. 1. Establecimiento del cultivo de organoides de h…

Representative Results

Los organoides hepatocitos de Alb-Cre femenino; Se observó ratón Rosa26-GFP (8 semanas) cinco días después de la siembra (Figura 1A). Los organoides están proliferando con tinción positiva de Ki67 (Figura 1B). La expresión interferente de genes representativos en organoides de hepatocitos, ya sea por transfección por siRNA o infección por lentivirus, se examinó mediante qRT-PCR y western blot. Los resultados se muestran en las Figu…

Discussion

La capacidad de cultivar hepatocitos maduros durante largos períodos es fundamental en el estudio de la ciencia básica del hígado, la toxicología de medicamentos y las infecciones hepatotrópicas de microbiología del huésped, como la malaria y los virus de la hepatitis. Con un nicho bien definido, el protocolo aquí establece un sistema de cultivo para hepatocitos. Este protocolo impulsa a los hepatocitos maduros a expandirse en cultivo 3D con una heterogeneidad que recapitula la interacción célula-célula, la fu…

Materials

Perfusion Buffer
EGTA	Sangon Bitech	A600077-0100	3.50 g/L
Glucose	Sangon Bitech	A100188-0500	9.00 g/L
KCl	Sangon Bitech	A100395-0500	4.00 g/L
Na2HPO4·12H2O	Sangon Bitech	A501727-0500	1.51 g/L
NaCl	Sangon Bitech	A501218-0001	80.0 g/L
NaH2PO4·2H2O	Sangon Bitech	A610404-0500	0.78 g/L
NaHCO3	Sangon Bitech	A500873-0500	3.50 g/L
Phenol Red	Sangon Bitech	A100882-0025	0.06 g/L
Digestion Buffer
CaCl2	Sangon Bitech	A501330-0005	0.50 M
Collagenase IV	Sigma	C1639	0.10 mg/mL
HEPES	Sangon Bitech	C621110-0010	23.80 g/L
KCl	Sangon Bitech	A100395-0500	4.00 g/L
Na2HPO4·12H2O	Sangon Bitech	A501727-0500	1.51 g/L
NaCl	Sangon Bitech	A501218-0001	80.0 g/L
NaH2PO4·2H2O	Sangon Bitech	A610404-0500	0.78 g/L
NaHCO3	Sangon Bitech	A500873-0500	3.50 g/L
Tip-wash Buffer
Fetal Bovine Serum	Gibco	10091148	stored at 4 °C
DPBS	Gibco	C14190500BT0	stored at 4 °C
Wash Medium
Advanced DMEM/F12	Invitrogen	12634-010	stored at 4 °C
GlutaMAX	Gibco	35050-061	100 X
HEPES	Gibco	15630-080	100 X
Penicillin/streptomycin	Sangon Bitech	A600135-0025	100 X
Culture Medium
A83-01	Tocris	2939	Stock concentration 500 µM, final concentration 2 µM
Advanced DMEM/F12	Invitrogen	12634-010	stored at 4 °C
B-27 supplement 50x, minus vitamin A	Gibco	1704-044	50 X
Chir 99021	Tocris	4423	Stock concentration 30 mM, final concentration 3 µM
DMEM/F12	Gibco	11330032	stored at 4 °C
Gastrin I	Tocris	3006	Stock concentration 100 mM, final concentration 10 nM
GlutaMAX	Gibco	35050-061	100 X
HEPES	Gibco	15630-080	100 X
Matrigel martix	BD	356231	stored at -20 °C
N-acetylcysteine	Sigma Aldrich	A9165	Stock concentration 500 mM, final concentration 1 mM
Nictinamide	Sigma Aldrich	N0636	Stock concentration 1 M, final concentration 3 mM
Penicillin/streptomycin	Sangon Bitech	A600135-0025	100 X
Recombinant human EGF	Peprotech	AF-100-15	Stock concentration 100 µg/ml,final concentration 50 ng/ml
Recombinant human FGF10	Peprotech	100-26	Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml
Recombinant human HGF	Peprotech	100-39	Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 25 ng/ml
Recombinant Human TGF-α	Peprotech	100-16A	Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml
Recombinant Human TNF-α	Origene	TP750007-1000	Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml
Rho kinase inhibitor Y-27632	Abmole Bioscience	Y-27632 dihydrochloride	Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM
Rspondin-1conditioned medium			Stable cell line generated in the Hu Lab. Final concentration 15%.
Others
0.22 µm filter	Millipore	SCGPT01RE
16 # silicone tube	LangerPump
24 well, suspension	Greiner bio-one	GN662102-100EA
37 °C Water Bath
70 µm filter	BD	352350
Accutase	stemcell	AT-104	stored at 4 °C
Anti-CTNNB1	BD	610154	Mouse
Anti-GAPDH	CST	5174S	Rabbit
Anti-HDAC7	Abcam	ab50212	Mouse
Anti-KI67	Abcam	ab15580	Rabbit
Biological safety cabinet	ESCO	CCL-170B-8
Cell Recovery Solution	Corning	354253	stored at 4 °C
Centrifuge 5430	eppendorf	542700097
CO2 incubator	ESCO	AC2-4S1
DMSO	Sangon Bitech	A100231	stored at RT
EVOS FL Color Imaging Systems	Invitrogen	AME4300
Hdac3 siRNA	Guangzhou RiboBio Co., Ltd.	siG2003180909192555	stored at -20 °C
Hdac7 lentivirus	ShanghaiGenePharmaCo.,Ltd	LV2020-2364	stored at -80 °C
Hitrans G A	Shanghai Genechem Co.,Ltd.	REVG004	Increased virus infection efficiency
Image Pro Plus software	Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA	version 6.0
Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent	Invitrogen	13778150	Increased virus infection efficiency
Live cell dye	Luna	F23001	stored at 4 °C
Low-speed desktop centrifuge	cence	TD5A-WS/TD5AWS
Nucleofactor-α 2b Device	Lonza
Opti-MEM	Gibco	31985070	stored at 4 °C
Pasteur pipette	Sangon Bitech	F621006-0001
Peristaltic pump	LangerPump	BT100-2J
PVDF membrane	Millipore	IPVH00010	Activate with methanol
PX458	Addgene	48138	stored at -80 °C
Refrigerated centrifuge	Thermo Scientific Heraeus	Labofuge 400
RSL3	MCE	HY-100218A	Stock concentration 10 mM, final concentration 4 µM
Trypsin/EDTA	Gibico	25200072	stored at 4 °C
Wee1 siRNA	Guangzhou RiboBio Co., Ltd.	siG2003180909205971	stored at -20 °C