이 기사는 근접성 및 말단 상피 폐 세포를 메센키메와 함께 포함하는 3차원 전체 폐 오르가노이드로 유도된 다능성 줄기 세포의 단계 현명한 분화를 설명합니다.
인간 폐 발달 및 질병은 생물학적으로 관련된 체외 모델 시스템의 부족으로 인해 연구하기가 어려웠습니다. 인간 유도만능 줄기 세포 (hiPSC)는 상피 및 중간 엽 세포 집단으로 만든 3D 다세포 폐 오르가노이드로 단계적으로 분화 될 수 있습니다. 우리는 다양한 성장 인자와 작은 분자를 효율적으로 생성하여 배아 발달 신호를 재구성하여 최종 엔도름, 전방 전방 전구 장부, 그리고 그 이후에 폐 선조 세포를 생성합니다. 이 세포는 그 때 감소된 성장 인자 감소 (GFR)-지하 막 매트릭스 매체에 내장되어, 그(것)들이 외부 성장 인자에 응하여 3D 폐 오르가노이드로 자발적으로 발전할 수 있게 합니다. 이 전체 폐 오르가노이드 (WLO)는 덱사메타손, 순환 앰프 및 이소부틸산틴에 노출 된 후 형성 형성 및 성숙을 포함한 초기 폐 발달 단계를 겪습니다. WlOs는 마커 KRT5 (기저), SCGB3A2 (클럽) 및 MUC5AC (잔)뿐만 아니라 HOPX (alveolar 타입 I) 및 SP-C (alveolar type II)를 표현하는 폐포 상피 세포를 발현하는 기도 상피 세포를 보유하고 있습니다. 중간엽 세포는 또한 평활근 액틴(SMA) 및 혈소판 유래 성장 인자 수용체 A(PDGFRα)를 포함하는 존재한다. iPSC 유래 WlOs는 몇 달 동안 3D 배양 조건에서 유지될 수 있으며 특정 세포 집단을 정화하기 위해 표면 마커를 위해 정렬될 수 있다. iPSC 유래 WlOs는 또한 폐 상피와 관혈 사이의 신호를 포함하여 인간의 폐 발달을 연구하고, 인간 폐 세포 기능 및 발달에 대한 유전 적 돌연변이를 모델링하고, 감염제의 세포 독성을 결정하는 데 활용될 수 있다.
폐는 배아, 의사, 캐날리큘러, 충류, 및 미세 혈관 성숙1,2 – 6 개의 별개의 단계에서 발전하는 복잡하고 이질적이며 역동적 인 기관입니다. 후자의 두 단계는 조산이 발생하지 않는 한 태아 발달 중에 독점적으로 발생하는 반면, 인간 발달에서 산후적으로 발생합니다3. 배아 단계는 내피 세균 층에서 시작하여 기관및 폐 싹의 신진으로 끝납니다. 폐 발달은 상피 세포와 중간엽 세포 4 사이의 신호를 통해 부분적으로 발생합니다. 이러한 상호 작용은 폐 분지, 증식, 세포 운명 결정 및 발전 폐의 세포 분화를 초래합니다. 폐는 전도 영역(말기 기관으로의 기관) 및 호흡기 영역(폐포에 대한 호흡기 기관지)으로 나뉩니다. 각 영역은 독특한 상피 세포 유형을 포함; 기저, 분비, 모양, 브러시, 신경 내분비 및 이오노세포 세포를 실시하는 기도55, 호흡 상피에서 폐포형 I 및 II 세포가 뒤따른다. 많은 개발 및 다양 한 세포 유형의 부상에 대 한 응답에 대 한 아직 알 수 없습니다. iPSC 유래 폐 오르가노이드 모델은 인간의 폐 발달을 유도하는 메커니즘, 폐 기능에 대한 유전 적 돌연변이의 효과 및 1 차적인 인간 폐 조직에 대한 필요없이 전염성 요원에 대한 상피 및 메센키메 의 반응을 가능하게합니다.
배아 분화의 다양한 단계에 대응하는 마커는 CXCR4, cKit, FOXA2 및 SOX17을 위한 최종 엔도드름(DE)7, FOXA2, TBX1 및 SOX2를 위한 전방 전방 배구 내분방(AFE)8, 및 초기 폐선세포에 대한 NKX2-1을 포함한다. 배아 폐 발달에서, 전장은 등쪽 식도와 복부 기관으로 분할합니다. 오른쪽과 왼쪽 폐의 싹은 기관 bud10 주위에 두 개의 독립적 인 외설로 나타납니다. 형태 발생을 분기하는 동안 상피를 둘러싼 중간 근막은 탄성 조직, 부드러운 근육, 연골 및 혈관11을 생성합니다. 상피와 메센키메 사이의 상호 작용은 정상적인 폐 발달에 필수적입니다. 여기에는 FGF1012의 분비성 및 상피에 의해 생성된 SHH13이 포함됩니다.
여기서, 우리는 hiPSC의 지시된 분화에 대한 프로토콜을 3차원(3D) 전체 폐 오르가노이드(WLO)로 기술한다. LPC 단계에서 분류를 통해 폐 전구 세포의 절연을 통합하여 폐포-유사 14,15(distal) 오르가노이드 또는 기도를 만드는 유사한 접근법이 있지만, 16(근접) 오르가노이드, 또는 폐포 세포와 중간엽 마커 및 버드 팁 선조 오르가노이드를 발현하는 인간 폐 오르가노이드를 만들기 위해 복부 전방 전구 스페로이드를 생성합니다17 , 이 방법의 강도는 폐 상피 및 중간엽 세포 유형을 패턴화하여 체외에서 폐 분지, 성숙 및 확장을 조율하는 것이다.
이 프로토콜은 작은 분자와 성장 인자를 사용하여 최종 엔데름, 전방 전방 배구 내분 및 폐 선조 세포를 통해 다능성 줄기 세포의 분화를 지시합니다. 이 세포는 그 때 분기및 성숙을 포함하여 중요한 발달 단계를 통해 3D 전체 폐 오르가노이드로 유도됩니다. 분화 프로토콜의 요약은 도 1b 에 도시된 내분피 및 오르가노이드 분화의 대표적인 브라이트필드 이미지와 함께 도 1a에 도시된다. 도 1c,d 는 분화를 완료한 후 폐 상피 세포의 근위 및 탈모 집단의 유전자 발현뿐만 아니라 내피 분화의 유전자 발현 세부 사항을 보여준다.
3D 전체 폐 오르가노이드 (WLO)의 성공적인 분화는 성장 인자와 소분자에 노출되는 시간, 패세후 세포 밀도 및 hiPSC의 품질을 포함하여 세부 사항에주의를 기울여 다단계 6 주 프로토콜에 의존합니다. 문제 해결의 경우 표 2를 참조하십시오. hiPSC는 약 70%-80%의 컨할 수 있어야 하며, 해리 전에 5% 미만의 자발적인 분화를 해야 합니다. 이 프로토콜은 “mTeSR 플러스”매체를 요구합니다. 그러나,…
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 재생 의학에 대 한 캘리포니아 연구소에 의해 지원 되었다 (CIRM) (DISC2-COVID19-12022).
Cell Culture | |||
12 well plates | Corning | 3512 | |
12-well inserts, 0.4um, translucent | VWR | 10769-208 | |
2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
Accutase | Innovative Cell Tech | AT104 | |
ascorbic acid | Sigma | A4544 | |
B27 without retinoic acid | ThermoFisher | 12587010 | |
Bovine serum albumin (BSA) Fraction V, 7.5% solution | Gibco | 15260-037 | |
Dispase | StemCellTech | 7913 | |
DMEM/F12 | Gibco | 10565042 | |
FBS | Gibco | 10082139 | |
Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
Ham’s F12 | Invitrogen | 11765-054 | |
HEPES | Gibco | 15630-080 | |
Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) + Glutamax | Invitrogen | 31980030 | |
Knockout Serum Replacement (KSR) | Life Technologies | 10828028 | |
Matrigel | Corning | 354230 | |
Monothioglycerol | Sigma | M6145 | |
mTeSR plus Kit (10/case) | Stem Cell Tech | 5825 | |
N2 | ThermoFisher | 17502048 | |
NEAA | Life Technologies | 11140050 | |
Pen/strep | Lonza | 17-602F | |
ReleSR | Stem Cell Tech | 5872 | |
RPMI1640 + Glutamax | Life Technologies | 12633012 | |
TrypLE | Gibco | 12605-028 | |
Y-27632 (Rock Inhibitor) | R&D Systems | 1254/1 | |
Growth Factors/Small Molecules | |||
Activin A | R&D Systems | 338-AC | |
All-trans retinoic acid (RA) | Sigma-Aldrich | R2625 | |
BMP4 | R&D Systems | 314-BP/CF | |
Br-cAMP | Sigma-Aldrich | B5386 | |
CHIR99021 | Abcam | ab120890 | |
Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
Dorsomorphin | R&D Systems | 3093 | |
EGF | R&D Systems | 236-EG | |
FGF10 | R&D Systems | 345-FG/CF | |
FGF7 | R&D Systems | 251-KG/CF | |
IBMX (3-Isobtyl-1-methylxanthine) | Sigma-Aldrich | I5879 | |
SB431542 | R&D Systems | 1614 | |
VEGF/PIGF | R&D Systems | 297-VP/CF | |
Primary antibodies | Dilution rate | ||
CXCR4-PE | R&D Systems | FAB170P | 1:200 (F) |
HOPX | Santa Cruz Biotech | sc-398703 | 0.180555556 |
HTII-280 | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | 0.145833333 |
KRT5 | Abcam | ab52635 | 0.180555556 |
NKX2-1 | Abcam | ab76013 | 0.25 |
NKX2-1-APC | LS-BIO | LS-C264437 | 1:1000 (F) |
proSPC | Abcam | ab40871 | 0.215277778 |
SCGB3A2 | Abcam | ab181853 | 0.25 |
SOX2 | Invitrogen | MA1-014 | 0.180555556 |
SOX9 | R&D Systems | AF3075 | 0.180555556 |
SPB (mature) | 7 Hills | 48604 | 1: 1500 (F) 1:500 (W)a |
SPC (mature) | LS Bio | LS-B9161 | 1:100 (F); 1:500 (W) a |