使用假病毒感染的高通量荧光成像检测SARS-CoV-2中和抗体
Summary
这里描述的方案概述了一种快速有效的方法来测量针对SARS-CoV-2刺突蛋白的中和抗体，方法是评估恢复期血清样品通过增强型绿色荧光蛋白标记的水泡性口炎病毒抑制感染的能力。
Abstract
随着由严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）引起的COVID-19大流行的不断发展，很明显，针对该病毒的中和抗体的存在可以提供针对未来感染的保护。因此，随着有效的COVID-19疫苗的创建和转化以前所未有的速度继续，开发快速有效的方法来测量针对SARS-CoV-2的中和抗体对于确定先前感染者和免疫个体的长期感染保护将变得越来越重要。本文介绍了一种高通量方案，该方案使用与SARS-CoV-2刺突蛋白假型的水泡性口炎病毒（VSV）来测量最近从COVID-19中康复的患者的恢复期血清中是否存在中和抗体。使用复制伪型病毒消除了SARS-CoV-2处理所需的3级收容设施的必要性，使几乎任何收容2级实验室都可以访问该协议。使用96孔格式允许同时运行许多样品，周转时间短至24小时。
Introduction
2019年12月，发现了一种新型冠状病毒，我们现在将其称为SARS-CoV-2，这是2019年冠状病毒病（COVID-19）的病原体1。SARS-CoV-2是一种属于 冠状病毒科 的β冠状病毒。这些包膜病毒组成了一个大的阳性感觉RNA基因组，负责人类和动物的呼吸道和肠道感染2。截至 2021 年 5 月，全球已报告超过 1.57 亿例 COVID-19 病例，超过 320 万人死亡3。开发有效的疫苗已成为全球研究人员的主要目标，至少有77种临床前疫苗正在研究中，90种目前正在进行临床试验4。
冠状病毒编码四种结构蛋白，包括刺突蛋白（S），核衣壳（N），包膜蛋白（E）和膜蛋白（M）。SARS-CoV-2的进入需要S的受体结合域（RBD）与宿主受体，人血管紧张素转换酶2（hACE2）的相互作用，以及随后的膜融合，随后通过宿主细胞丝氨酸蛋白酶，跨膜蛋白酶丝氨酸2（TMPRSS2）5，6，7，8，9，10.SARS-CoV的S蛋白的体液免疫优势以前已有报道，现在也被证明用于SARS-CoV-2 11，12，13。事实上，在感染24个月后，在SARS-CoV患者的恢复期血清中检测到针对S的中和抗体反应14，突出了它们在长期免疫反应中的关键作用。S蛋白已被确定为一种有前途的疫苗靶标，因此已成为大多数正在开发的疫苗的关键成分15，16。
虽然快速检测中和抗体是疫苗开发的一个关键方面，但它也可能揭示受影响地区的感染率和血清流行病学监测17。Whelan及其同事捐赠了一种具有复制能力的VSV假型，用SARS-CoV-2 S糖蛋白代替野生型VSV糖蛋白，在生物安全2级环境中研究SARS-CoV-2感染18。VSV表达尖峰（VSV-S）将用于确定针对SARS-CoV-2刺突蛋白的中和抗体反应。由于这里使用的VSV-S也表达增强的绿色荧光蛋白（eGFP），因此可以在24小时内检测到eGFP病灶以量化感染，而斑块形成可能需要48至72小时。这里总结的是一个简单有效的方案，用于确定恢复期患者血清中和VSV-S-eGFP感染的能力。这种方法也可以很容易地适应于询问其他潜在的治疗方法，这些疗法旨在破坏SARS-CoV-2 S蛋白的宿主 – 病毒相互作用。
Protocol
Representative Results
Discussion
此处描述的方法可以根据需要进行调整，以适应不同的实验室环境和资源。重要的是，该协议的主要局限性是需要2级密封空间和组织培养罩。应用具有SARS-CoV-2尖峰的复制RNA病毒假型，如VSV-S-eGFP，是SARS-CoV-2病毒的强大替代品，SARS-CoV-2病毒需要3级工作区域，但对于某些群体来说可能仍然是一个限制。此处描述的所有其他步骤都非常灵活，几乎可以在任何2级密闭实验室中执行。例如，不需要使用具…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们要感谢惠兰实验室慷慨地提供了该协议中使用的VSV-S-eGFP病毒（在Case et al. 2020中描述）。我们还感谢Bill Cameron博士和Juthaporn Cowan博士（以及团队）收集患者血液样本（REB协议ID 20200371-01H）。作者披露了对本文的研究，作者身份和/或发表的以下财务支持：这项工作由渥太华医院基金会的慷慨支持和加拿大卫生研究院（#448323）的赠款以及Thistledown COVID-19科学基金会向C.S.I.T.R.J.的快速资助资助，由安大略省研究生奖学金和集群Mitacs奖学金资助。JP由集群Mitacs奖学金资助。T.A.由CIHR Banting奖学金资助。我们还要感谢所有参与并为这项研究捐献血液样本的个人。
Materials
| 0.25% trypsin-EDTA (Gibco) | Fisher scientific | LS25200114 | |
| ArrayScan VTI HCS | Thermo Fisher Scientific | Automated fluorescent imager | |
| carboxymethyl cellulose | Sigma | C5678 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (Gibco) | Fisher scientific | 10-013-CV | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (Powder) (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 12-800-017 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Fisher scientific | 21-031-CV | |
| HEPES | Fisher scientific | BP-310-500 | |
| IgG Isotype Control (mouse) | Thermo Fisher Scientific | 31903 | |
| Penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab | SinoBiological | 40592-MM57 | |
| Vero E6 cells | ATCC | CRL-1586 |
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