Påvisning av SARS-CoV-2 reseptorbindende domeneantistoff ved hjelp av en HiBiT-basert bioreporter
Summary
Den skisserte protokollen beskriver prosedyren for å produsere HiBiT-reseptorbindingsdomeneproteinkomplekset og dets anvendelse for rask og sensitiv deteksjon av SARS-CoV-2-antistoffer.
Abstract
Fremveksten av COVID-19-pandemien har økt behovet for bedre serologiske deteksjonsmetoder for å bestemme den epidemiologiske effekten av alvorlig akutt respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Det økende antallet SARS-CoV-2-infeksjoner øker behovet for bedre antistoffdeteksjonsanalyser. Nåværende antistoffdeteksjonsmetoder kompromitterer følsomhet for hastighet eller er følsomme, men tidkrevende. En stor andel av SARS-CoV-2-nøytraliserende antistoffer retter seg mot reseptorbindingsdomenet (RBD), et av de primære immunogene rommene i SARS-CoV-2. Vi har nylig designet og utviklet en svært følsom, bioluminescent-merket RBD (NanoLuc HiBiT-RBD) for å oppdage SARS-CoV-2 antistoffer. Følgende tekst beskriver prosedyren for å produsere HiBiT-RBD-komplekset og en rask analyse for å evaluere tilstedeværelsen av RBD-målrettede antistoffer ved hjelp av dette verktøyet. På grunn av holdbarheten til HiBiT-RBD-proteinproduktet over et bredt spekter av temperaturer og den kortere eksperimentelle prosedyren som kan fullføres innen 1 time, kan protokollen betraktes som et mer effektivt alternativ for å oppdage SARS-CoV-2 antistoffer i pasientserumprøver.
Introduction
Den nylige fremveksten av et nytt koronavirus, SARS-CoV21, har forårsaket mer enn 2.800.000 dødsfall og 128 millioner infeksjoner per 30. På grunn av mangelen på en pålitelig og veletablert behandlingsprosedyre for SARS-CoV-2 kliniske terapier, har mange bestrebelser blitt gjort for å begrense ytterligere virusoverføring og enda viktigere, for å utvikle en effektiv og robust behandling eller en vaksine3. Til dags dato er det mer enn 50 COVID-19 vaksinekandidater i studier rapportert av Verdens helseorganisasjon4. Påvisning av antistoffer mot SARS-CoV-2 er av avgjørende betydning for å bestemme den langsiktige stabiliteten av humoral respons ved administrering av vaksinen, så vel som hos gjenopprettede pasienter av COVID-195. Noen studier har vist at det er en mulighet for at gjenvunne sars-cov-2 pasienter mister de fleste av RBD-bindende antistoffer etter 1 år5,6,7,8,9. Videre undersøkelser er nødvendig for å bedre forstå varig immunitet, og mer sensitive antistoffdeteksjonsplattformer kan bidra til å fremme slikt arbeid. Rapporter om vedvarende immunitet av milde SARS-CoV-2-infeksjoner, som antyder langsiktige antistoffresponser, er også et interessant og verdig studieområde. En rask og nøyaktig metode for deteksjon er avgjørende for å overvåke antistoffer i individets sera for å gi mer informasjon om immunitet i befolkningen.
Som andre koronavirus bruker SARS-CoV-2 fremspringende spike glykoprotein for å binde seg til angiotensinkonverterende enzym-2 (ACE2) for å initiere en kaskade av hendelser som fører til sammensmelting av virale og cellemembraner6,7. Flere studier har nylig vist at RBD for Spike-proteinet har en avgjørende rolle i å fremkalle kraftig og spesifikk antistoffrespons mot SARS-CoV28,9,10,11. Spesielt er korrelasjoner observert av Premkumar et al. mellom titeret av RBD-bindende antistoff og SARS-CoV-2 nøytraliseringsstyrke av pasientens plasma i samsvar med at RBD er et immunogent rom i virusstrukturen9. Med det i tankene er mange diagnostiske tester tilgjengelig for SARS-CoV-2 antistoffdeteksjon tids- og kostnadskrevende, krever en langvarig prosedyre for inkubasjon og vasking (enzymbundet immunosorbentanalyse [ELISA]), eller mangler følsomhet og nøyaktighet (lateral flow immunoassay [LFIA])12. Derfor vil en kvantitativ og rask komplementær serologisk metode for COVID-19-avledet antistoffdeteksjon med høy følsomhet, rask respons og relativt lave kostnader tjene behovet for en pålitelig serologisk test for SARS-CoV-2 epidemiologisk overvåking.
Samlet førte begrensningene til nåværende serologiske analyser til undersøkelsen av det bioluminescerende rapporteringssystemet som et potensielt diagnostisk middel i fremtidige serosurveys. Bioluminescens er en naturlig forekommende enzym/substratreaksjon, med lysutslipp. Nanoluc luciferase er den minste (19 kDa), men det lyseste systemet sammenlignet med Renilla og firefly luciferase (henholdsvis 36 kDa og 61 kDa)13,14. Videre har Nanoluc det høyeste signal-til-støy-forholdet og stabiliteten blant de tidligere nevnte systemene. Nanolucs høye signalintensitet støtter påvisning av selv svært lave mengder reporterfusjoner15. Nanoluc Binary Technology (NanoBiT) er en delt versjon av Nanoluc-systemet, som består av to segmenter: liten BiT (11 aminosyrer; SmBiT) og store BiT (LgBiT) med relativt lav affinitetsinteraksjoner (KD = 190 μM ) for å danne et lysende kompleks16. NanoBiT brukes mye i ulike studier som involverer identifisering av proteinproteininteraksjoner15,17,18,19 og cellulære signalveier11,20,21.
Nylig ble et annet lite peptid med en tydelig høyere affinitet til LgBiT (KD = 0,7 nM ) introdusert, nemlig HiBiT Nano-Glo-systemet, i stedet for SmBiT. Den høye affiniteten og det sterke signalet fra Nano-Glo-analysen “add-mix-read” gjør HiBiT til en passende, kvantitativ, lysende peptidkode. I denne tilnærmingen legges HiBiT-taggen til målproteinet ved å utvikle en konstruksjon som pålegger minimal strukturell interferens. HiBiT-proteinfusjon ville aktivt binde seg til LgBiT-motparten, og produsere et svært aktivt luciferaseenzym for å generere påviselig bioluminescens i nærvær av deteksjonsreagenser (figur 1). På samme måte utviklet vi et HiBiT Nano-Glo-basert system for å enkelt måle det nøytraliserende antistofftitren i sera av SARS-CoV-2 gjenopprettede individer og utviklet nylig en HiBiT-merket SARS-CoV-2 RBD. Dette dokumentet beskriver protokollen for produksjon av HiBiT-RBD bioreporter ved hjelp av standard laboratorieprosedyrer og utstyr, og viser hvordan denne bioreporteren kan brukes i en rask og effektiv analyse for å oppdage SARS-CoV-2 RBD-målrettede antistoffer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det økende antallet personer som er smittet med SARS-CoV-2 og den pågående innsatsen for global vaksinasjon, krever sensitive og raske serologiske tester som kan brukes i store serosurveys. Nyere forskning viser at splittede nanoluciferasebaserte bioreportere kan brukes til å utvikle slike analyser. Vi utviklet nylig HiBiT-RBD bioreporter for å designe en test som kan brukes til å oppdage SARS-CoV-2-spesifikke antistoffer i pasientserum på en rask og pålitelig måte (figur 4C).
<…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi setter pris på og takker den tekniske hjelpen til Xiaohong He, Ricardo Marius, Julia Petryk, Bradley Austin og Christiano Tanese De Souza. Vi takker også Mina Ghahremani for grafisk design. Vi vil også takke alle personene som deltok og donerte blodprøvene sine for denne studien. DWC støttes delvis av uOttawa Fakultet og Institutt for medisin.
Materials
| 5x Passive Lysis Buffer | Promega | E194A | 30 mL |
| Bio-Plex Handheld Magnetic Washer | Bio-Rad | 171020100 | |
| DMEM | Sigma | D6429-500ml | |
| Dual-Glo luciferase Assay System | Promega | E2940 | 100 mL kit |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F1051 | |
| HiBiT-RBD Plasmid | gacggatcgggagatctcccgatcccctatggt gcactctcagtacaatctgctctgatgccgcata gttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttgg aggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaattta agctacaacaaggcaaggcttgaccgacaa ttgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttg cgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgc gttgacattgattattgactagttattaatagt aatcaattacggggtcattagttcatagcccat atatggagttccgcgttacataacttacggtaa atggcccgcctggctgaccgcccaacgaccc ccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttccc atagtaacgccaatagggactttccattgacgtc aatgggtggagtatttacggtaaactgcccact tggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagta cgccccctattgacgtcaatgacggtaaatgg cccgcctggcattatgcccagtacatgaccttat gggactttcctacttggcagtacatctacgtat tagtcatcgctattaccatggtgatgcggtttt ggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttg actcacggggatttccaagtctccaccccattg acgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatc aacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccg ccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgta cggtgggaggtctatataagcagagctctctgg ctaactagagaacccactgcttactggcttatcg aaattaatacgactcactatagggagacccaa gctggctagcgtttaaacttaagcttggtaccga gctcggatccgccaccATGGAGACAGA CACACTCCTGCTATGGGTACTGC TGCTCTGGGTTCCAGGTTCCAC TGGTGACtctggctctagcggctctggctct agcggcggcATGGTGAGCGGCTG GCGGCTGTTCAAGAAGATTAGC tctagcggcGACTACAAGGACC ACGACGGTGACTACAAGGACCA CGACATCGACTACAAGGACGAC GACGACAAGggcagcggctccggca gcagcggaggaggaggctctggaggagga ggctctagcggcggcaacatcacaaatctgtg cccattcggcgaggtgtttaacgccaccagat ttgccagcgtgtatgcctggaaccggaagaga atctctaattgcgtggccgactatagcgtgct gtacaatagcgcctccttctctacctttaagt gctatggcgtgtcccccacaaagctgaacgac ctgtgcttcaccaacgtgtacgccgactcttttgt gatcaggggcgatgaggtgcgccagatcgc acctggacagacaggcaagatcgccgactac aactataagctgccagacgatttcaccggct gcgtgatcgcctggaatagcaacaatctggatt ccaaagtgggcggcaactacaattatctgtac cggctgttcagaaagagcaacctgaagccctt tgagcgggatatcagcacagagatctaccag gcaggctccaccccttgcaacggagtggagg gcttcaattgttattttcccctgcagagctacggc ttccagcctacaaatggcgtgggctatcagcca tacagggtggtggtgctgtcctttgagctgctg cacgcacctgcaaccgtgtcctctggacacatc gagggccgccacatgctggagatgggccatc atcaccatcatcaccaccaccaccactgatag cggccgctcgagtctagagggcccgtttaaac ccgctgatcagcctcgactgtgccttctagtt gccagccatctgttgtttgcccctcccccgtg ccttccttgaccctggaaggtgccactcccac tgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcat cgcattgtctgagtaggtgtcattctattctgggg ggtggggtggggcaggacagcaaggggga ggattgggaagacaatagcaggcatgctggg gatgcggtgggctctatggcttctgaggcggaa agaaccagctggggctctagggggtatcccca cgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcg ggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctac acttgccagcgccctagcgcccgctcctttcg ctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctt tccccgtcaagctctaaatcgggggctcccttta gggttccgatttagtgctttacggcacctcgacc ccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgta gtgggccatcgccctgatagacggtttttcgcc ctttgacgttggagtccacgttctttaatagtg gactcttgttccaaactggaacaacactcaacc ctatctcggtctattcttttgatttataagggatttt gccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctg atttaacaaaaatttaacgcgaattaattctgt ggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccc caggctccccagcaggcagaagtatgcaaag catgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtgg aaagtccccaggctccccagcaggcagaagt atgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaac catagtcccgcccctaactccgcccatcccgc ccctaactccgcccagttccgcccattctccgcc ccatggctgactaattttttttatttatgcagaggc cgaggccgcctctgcctctgagctattccagaa gtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttg caaaaagctcccgggagcttgtatatccattttc ggatctgatcaagagacaggatgaggatcgttt cgcatgattgaacaagatggattgcacgcagg ttctccggccgcttgggtggagaggctattcggc tatgactgggcacaacagacaatcggctgctct gatgccgccgtgttccggctgtcagcgcagggg cgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccgg tgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcg cggctatcgtggctggccacgacgggcgttcct tgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcg ggaagggactggctgctattgggcgaagtgcc ggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctg ccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatg cggcggctgcatacgcttgatccggctacctgc ccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcg agcgagcacgtactcggatggaagccggtct tgtcgatcaggatgatctggacgaagagcat caggggctcgcgccagccgaactgttcgcca ggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgagg atctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttg ccgaatatcatggtggaaaatggccgctttt ctggattcatcgactgtggccggctgggtgt ggcggaccgctatcaggacatagcgttggct acccgtgatattgctgaagagcttggcggcg aatgggctgaccgcttcctcgtgctttacgg tatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgcc ttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcg ggactctggggttcgaaatgaccgaccaag cgacgcccaacctgccatcacgagatttcgat tccaccgccgccttctatgaaaggttgggctt cggaatcgttttccgggacgccggctggatga tcctccagcgcggggatctcatgctggagt tcttcgcccaccccaacttgtttattgcagctta taatggttacaaataaagcaatagcatcacaa atttcacaaataaagcatttttttcactgcatt ctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtat cttatcatgtctgtataccgtcgacctctagct agagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttc ctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacac aacatacgagccggaagcataaagtgtaaag cctggggtgcctaatgagtgagctaactcacat taattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtc gggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaa tcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcg tattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactc gctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggt atcagctcactcaaaggcggtaatacggttatc cacagaatcaggggataacgcaggaaagaa catgtgagcaaaaggccagcaaaaggccag gaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttt tccataggctccgcccccctgacgagcatcac aaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaa acccgacaggactataaagataccaggcgtt tccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgtt ccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcc tttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcat agctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtag gtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaa ccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatcc ggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaag acacgacttatcgccactggcagcagccactg gtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggc ggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaact acggctacactagaagaacagtatttggtatc tgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaa aagagttggtagctcttgatccggcaaacaaa ccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgca agcagcagattacgcgcagaaaaaaaggat ctcaagaagatcctttgatcttttctacggggt ctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaa gggattttggtcatgagattatcaaaaaggatct tcacctagatccttttaaattaaaaatgaagtt ttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaactt ggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgagg cacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatcca tagttgcctgactccccgtcgtgtagataactac gatacgggagggcttaccatctggccccagtg ctgcaatgataccgcgagacccacgctcacc ggctccagatttatcagcaataaaccagccag ccggaagggccgagcgcagaagtggtcctg caactttatccgcctccatccagtctattaattgtt gccgggaagctagagtaagtagttcgccagtt aatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacag gcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatgg cttcattcagctccggttcccaacgatcaaggc gagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaag cggttagctccttcggtcctccgatcgttgtca gaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggt tatggcagcactgcataattctcttactgtcatg ccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagta ctcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcg gcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacg ggataataccgcgccacatagcagaactttaa aagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggc gaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagat ccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaact gatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttc tgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgc cgcaaaaaagggaataagggcgacacgga aatgttgaatactcatactcttcctttttcaat attattgaagcatttatcagggttattgtc tcatgagcggatacatatttgaatgtattt agaaaaataaacaaataggggttccgcgca catttccccgaaaagtgccacctgacgtc | ||
| LgBiT | Promega | N3030 | |
| penicillin Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Pierce Protein G Magnetic Beads | Thermo Fisher Scientific | 88848 | |
| PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent | Signagen | SL100688.5 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab | SinoBiological | 40592-MM57 | |
| Synergy Mx Microplate Reader | BioTek | 96-well plate reader luminometer | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 2520056 | 0.25% |
References
- Ullah, H., Ullah, A., Gul, A., Mousavi, T., Khan, M. W. Novel coronavirus 2019 (COVID-19) pandemic outbreak: A comprehensive review of the current literature. Vacunas. , (2020).
- Coronavirus update (Live). Worldometer Available from: https://www.worldometers.info/coronavirus/ (2021)
- Cacciapaglia, G., Cot, C., Sannino, F. Second wave COVID-19 pandemics in Europe: a temporal playbook. Scientific Reports. 10 (1), 15514 (2020).
- COVID-19 vaccines. World Health Organization Available from: https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/covid-19-vaccines (2021)
- Hueston, L., et al. The antibody response to SARS-CoV-2 infection. Open Forum Infectious Diseases. 7 (9), (2020).
- Lan, J., et al. Structure of the SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain bound to the ACE2 receptor. Nature. 581 (7807), 215-220 (2020).
- Azad, T., et al. Implications for SARS-CoV-2 vaccine design: fusion of Spike glycoprotein transmembrane domain to receptor-binding domain induces trimerization. Membranes. 10 (9), 215 (2020).
- Piccoli, L., et al. Mapping neutralizing and immunodominant sites on the SARS-CoV-2 Spike receptor-binding domain by structure-guided high-resolution serology. Cell. 183 (4), 1024-1042 (2020).
- Premkumar, L., et al. The receptor-binding domain of the viral spike protein is an immunodominant and highly specific target of antibodies in SARS-CoV-2 patients. Science Immunology. 5 (48), (2020).
- Walls, A. C., et al. Elicitation of potent neutralizing antibody responses by designed protein nanoparticle vaccines for SARS-CoV-2. Cell. 183 (5), 1367-1382 (2020).
- Azad, T. Nanoluciferase complementation-based biosensor reveals the importance of N- linked glycosylation of SARS-CoV-2 Spike for viral entry. Mol Ther. , 0074-0075 (2021).
- Bastos, M. L., et al. Diagnostic accuracy of serological tests for covid-19: systematic review and meta-analysis. BMJ. 370, 2516 (2020).
- Bioluminescent Reporters | Reporter Gene Applications | An Introduction to Reporter Genes. Promega Available from: https://www.promega.ca/resources/guides/cell-biology/bioluminescent-reporters/#references-6d127eb8-eeae-40b7-86e9-fe300545e8fa (2021)
- Fleiss, A., Sarkisyan, K. S. A brief review of bioluminescent systems. Current Genetics. 65 (4), 877-882 (2019).
- Nouri, K., et al. A kinome-wide screen using a NanoLuc LATS luminescent biosensor identifies ALK as a novel regulator of the Hippo pathway in tumorigenesis and immune evasion. The FASEB Journal. 33 (11), 12487-12499 (2019).
- Boute, N., et al. NanoLuc Luciferase – a multifunctional tool for high throughput antibody screening. Frontiers in Pharmacology. 7, 27 (2016).
- Nouri, K., et al. Identification of celastrol as a novel YAP-TEAD inhibitor for cancer therapy by high throughput screening with ultrasensitive YAP/TAZ-TEAD biosensors. Cancers. 11 (10), 1596 (2019).
- Azad, T., et al. SARS-CoV-2 S1 NanoBiT: A nanoluciferase complementation-based biosensor to rapidly probe SARS-CoV-2 receptor recognition. Biosensors and Bioelectronics. 180, 113122 (2021).
- Brown, E. E. F., et al. Characterization of critical determinants of ACE2-SARS CoV-2 RBD interaction. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2268 (2021).
- Azad, T., et al. A gain-of-functional screen identifies the Hippo pathway as a central mediator of receptor tyrosine kinases during tumorigenesis. Oncogene. 39 (2), 334-355 (2020).
- Schwinn, M. K., et al. CRISPR-Mediated tagging of endogenous proteins with a luminescent peptide. ACS Chemical Biology. 13 (2), 467-474 (2018).
- Azad, T., et al. A high-throughput NanoBiT-based serological assay detects SARS-CoV-2 seroconversion. Nanomaterials. 11 (3), 807 (2021).
