Nachweis eines SARS-CoV-2-Rezeptor-bindenden Domänenantikörpers mit einem HiBiT-basierten Bioreporter
Summary
Das skizzierte Protokoll beschreibt das Verfahren zur Herstellung des HiBiT-Rezeptor-bindenden Domänenproteinkomplexes und seine Anwendung für den schnellen und sensitiven Nachweis von SARS-CoV-2-Antikörpern.
Abstract
Das Auftreten der COVID-19-Pandemie hat den Bedarf an besseren serologischen Nachweismethoden erhöht, um die epidemiologischen Auswirkungen des schweren akuten respiratorischen Syndroms Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) zu bestimmen. Die steigende Zahl von SARS-CoV-2-Infektionen erhöht den Bedarf an besseren Antikörper-Nachweis-Assays. Aktuelle Antikörper-Nachweismethoden beeinträchtigen die Empfindlichkeit in Bezug auf Geschwindigkeit oder sind empfindlich, aber zeitaufwendig. Ein großer Teil der SARS-CoV-2-neutralisierenden Antikörper zielt auf die Rezeptorbindungsdomäne (RBD) ab, eines der primären immunogenen Kompartimente von SARS-CoV-2. Wir haben kürzlich ein hochempfindliches, biolumineszenz-markiertes RBD (NanoLuc HiBiT-RBD) zum Nachweis von SARS-CoV-2-Antikörpern entworfen und entwickelt. Der folgende Text beschreibt das Verfahren zur Herstellung des HiBiT-RBD-Komplexes und eines schnellen Assays zur Bewertung des Vorhandenseins von RBD-Targeting-Antikörpern mit diesem Tool. Aufgrund der Haltbarkeit des HiBiT-RBD-Proteinprodukts über einen weiten Temperaturbereich und des kürzeren experimentellen Verfahrens, das innerhalb von 1 h abgeschlossen werden kann, kann das Protokoll als effizientere Alternative zum Nachweis von SARS-CoV-2-Antikörpern in Patientenserumproben angesehen werden.
Introduction
Das jüngste Auftreten eines neuen Coronavirus, SARS-CoV21, hat bis zum 30. März 20212 mehr als 2.800.000 Todesfälle und 128 Millionen Infektionen verursacht. Aufgrund des Fehlens eines zuverlässigen und gut etablierten Behandlungsverfahrens für klinische SARS-CoV-2-Therapien wurden viele Anstrengungen unternommen, um die weitere Virusübertragung einzuschränken und vor allem eine wirksame und robuste Behandlung oder einen Impfstoff zu entwickeln3. Bis heute gibt es mehr als 50 COVID-19-Impfstoffkandidaten in Studien, die von der Weltgesundheitsorganisation gemeldet wurden4. Der Nachweis von Antikörpern gegen SARS-CoV-2 ist von größter Bedeutung, um die langfristige Stabilität des humoralen Ansprechens bei Verabreichung des Impfstoffs sowie bei genesenen Patienten mit COVID-195 zu bestimmen. Einige Studien haben gezeigt, dass die Möglichkeit besteht, dass genesene SARS-CoV-2-Patienten nach 1 Jahr die meisten RBD-bindenden Antikörper verlieren5,6,7,8,9. Weitere Untersuchungen sind erforderlich, um die dauerhafte Immunität besser zu verstehen, und empfindlichere Antikörpernachweisplattformen können dazu beitragen, diese Arbeit voranzutreiben. Berichte über eine anhaltende Immunität gegen leichte SARS-CoV-2-Infektionen, die auf langfristige Antikörperreaktionen hindeuten, sind ebenfalls ein interessantes und lohnendes Studiengebiet. Eine schnelle und genaue Nachweismethode ist für die Überwachung von Antikörpern in den Seren von Individuen unerlässlich, um mehr Informationen über die Immunität in der Bevölkerung zu erhalten.
Wie andere Coronaviren verwendet SARS-CoV-2 hervorstehendes Spike-Glykoprotein, um an das Angiotensin-Converting-Enzym-2 (ACE2) zu binden, um eine Kaskade von Ereignissen auszulösen, die zur Fusion der Virus- und Zellmembranen führen6,7. Mehrere Studien haben kürzlich bewiesen, dass die RBD des Spike-Proteins eine entscheidende Rolle bei der Auslösung einer starken und spezifischen Antikörperantwort gegen SARS-CoV28,9,10,11 spielt. Insbesondere die von Premkumar et al. beobachteten Korrelationen zwischen dem Titer des RBD-bindenden Antikörpers und der SARS-CoV-2-Neutralisationskraft des Patientenplasmas stimmen mit RBD als immunogenem Kompartiment der Virusstruktur überein9. Vor diesem Hintergrund sind viele diagnostische Tests, die für den Nachweis von SARS-CoV-2-Antikörpern verfügbar sind, zeit- und kostenintensiv, erfordern ein langwieriges Inkubations- und Waschverfahren (Enzym-Linked Immunosorbent Assay [ELISA]) oder es mangelt ihnen an Sensitivität und Genauigkeit (Lateral-Flow-Immunoassay [LFIA])12. Daher würde eine quantitative und schnelle komplementäre serologische Methode des COVID-19-abgeleiteten Antikörpernachweises mit hoher Sensitivität, schnellem Ansprechen und relativ geringen Kosten die Notwendigkeit eines zuverlässigen serologischen Tests für die epidemiologische Überwachung von SARS-CoV-2 decken.
Insgesamt führten die Einschränkungen der aktuellen serologischen Assays zur Untersuchung des Biolumineszenz-Meldesystems als potenzielles Diagnostikum in zukünftigen Serosurveys. Biolumineszenz ist eine natürlich vorkommende Enzym/Substrat-Reaktion mit Lichtemission. Nanoluc-Luciferase ist das kleinste (19 kDa), aber das hellste System im Vergleich zu Renilla– und Glühwürmchen-Luciferase (36 kDa bzw. 61 kDa)13,14. Darüber hinaus hat Nanoluc das höchste Signal-Rausch-Verhältnis und die höchste Stabilität unter den zuvor genannten Systemen. Die hohe Signalintensität von Nanoluc unterstützt den Nachweis selbst sehr geringer Mengen an Reporterfusionen15. Nanoluc Binary Technology (NanoBiT) ist eine splitte Version des Nanoluc-Systems, das aus zwei Segmenten besteht: kleine BiT (11 Aminosäuren; SmBiT) und große BiT (LgBiT) mit relativ affinitätsarmen Wechselwirkungen (KD = 190 μM) zu einem Lumineszenzkomplex16. NanoBiT wird in verschiedenen Studien zur Identifizierung von Protein-Protein-Interaktionen15,17,18,19 und zellulären Signalwegen eingesetzt11,20,21.
Kürzlich wurde ein weiteres kleines Peptid mit einer deutlich höheren Affinität zu LgBiT (KD = 0,7 nM) eingeführt, nämlich das HiBiT Nano-Glo-System anstelle von SmBiT. Die hohe Affinität und das starke Signal des Nano-Glo “add-mix-read”-Assays machen HiBiT zu einem geeigneten, quantitativen, lumineszierenden Peptid-Tag. Bei diesem Ansatz wird das HiBiT-Tag an das Zielprotein angehängt, indem ein Konstrukt entwickelt wird, das minimale strukturelle Interferenzen aufweist. Die HiBiT-Protein-Fusion würde aktiv an das LgBiT-Gegenstück binden und ein hochaktives Luciferase-Enzym produzieren, um in Gegenwart von Nachweisreagenzien nachweisbare Biolumineszenz zu erzeugen (Abbildung 1). In ähnlicher Weise haben wir ein HiBiT Nano-Glo-basiertes System entwickelt, um den neutralisierenden Antikörpertiter in den Seren von SARS-CoV-2-genesenen Individuen leicht zu messen, und kürzlich einen HiBiT-markierten SARS-CoV-2 RBD entwickelt. Dieser Artikel beschreibt das Protokoll zur Herstellung des HiBiT-RBD-Bioreporters unter Verwendung von Standardlaborverfahren und -geräten und zeigt, wie dieser Bioreporter in einem schnellen und effizienten Assay zum Nachweis von SARS-CoV-2 RBD-Targeting-Antikörpern verwendet werden kann.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die steigende Zahl von Menschen, die mit SARS-CoV-2 infiziert sind, und die anhaltenden Bemühungen um eine globale Impfung erfordern empfindliche und schnelle serologische Tests, die in groß angelegten Serosurveys eingesetzt werden können. Jüngste Forschungen zeigen, dass Split-Nanoluciferase-basierte Bioreporter verwendet werden können, um solche Assays zu entwickeln. Wir haben kürzlich den HiBiT-RBD-Bioreporter entwickelt, um einen Test zu entwickeln, mit dem SARS-CoV-2-spezifische Antikörper im Patientenserum s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir schätzen und danken der technischen Unterstützung von Xiaohong He, Ricardo Marius, Julia Petryk, Bradley Austin und Christiano Tanese De Souza. Wir danken auch Mina Ghahremani für Grafikdesign. Wir möchten uns auch bei allen Personen bedanken, die teilgenommen und ihre Blutproben für diese Studie gespendet haben. DWC wird zum Teil von der uOttawa Fakultät und abteilung für Medizin unterstützt.
Materials
| 5x Passive Lysis Buffer | Promega | E194A | 30 mL |
| Bio-Plex Handheld Magnetic Washer | Bio-Rad | 171020100 | |
| DMEM | Sigma | D6429-500ml | |
| Dual-Glo luciferase Assay System | Promega | E2940 | 100 mL kit |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F1051 | |
| HiBiT-RBD Plasmid | gacggatcgggagatctcccgatcccctatggt gcactctcagtacaatctgctctgatgccgcata gttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttgg aggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaattta agctacaacaaggcaaggcttgaccgacaa ttgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttg cgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgc gttgacattgattattgactagttattaatagt aatcaattacggggtcattagttcatagcccat atatggagttccgcgttacataacttacggtaa atggcccgcctggctgaccgcccaacgaccc ccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttccc atagtaacgccaatagggactttccattgacgtc aatgggtggagtatttacggtaaactgcccact tggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagta cgccccctattgacgtcaatgacggtaaatgg cccgcctggcattatgcccagtacatgaccttat gggactttcctacttggcagtacatctacgtat tagtcatcgctattaccatggtgatgcggtttt ggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttg actcacggggatttccaagtctccaccccattg acgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatc aacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccg ccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgta cggtgggaggtctatataagcagagctctctgg ctaactagagaacccactgcttactggcttatcg aaattaatacgactcactatagggagacccaa gctggctagcgtttaaacttaagcttggtaccga gctcggatccgccaccATGGAGACAGA CACACTCCTGCTATGGGTACTGC TGCTCTGGGTTCCAGGTTCCAC TGGTGACtctggctctagcggctctggctct agcggcggcATGGTGAGCGGCTG GCGGCTGTTCAAGAAGATTAGC tctagcggcGACTACAAGGACC ACGACGGTGACTACAAGGACCA CGACATCGACTACAAGGACGAC GACGACAAGggcagcggctccggca gcagcggaggaggaggctctggaggagga ggctctagcggcggcaacatcacaaatctgtg cccattcggcgaggtgtttaacgccaccagat ttgccagcgtgtatgcctggaaccggaagaga atctctaattgcgtggccgactatagcgtgct gtacaatagcgcctccttctctacctttaagt gctatggcgtgtcccccacaaagctgaacgac ctgtgcttcaccaacgtgtacgccgactcttttgt gatcaggggcgatgaggtgcgccagatcgc acctggacagacaggcaagatcgccgactac aactataagctgccagacgatttcaccggct gcgtgatcgcctggaatagcaacaatctggatt ccaaagtgggcggcaactacaattatctgtac cggctgttcagaaagagcaacctgaagccctt tgagcgggatatcagcacagagatctaccag gcaggctccaccccttgcaacggagtggagg gcttcaattgttattttcccctgcagagctacggc ttccagcctacaaatggcgtgggctatcagcca tacagggtggtggtgctgtcctttgagctgctg cacgcacctgcaaccgtgtcctctggacacatc gagggccgccacatgctggagatgggccatc atcaccatcatcaccaccaccaccactgatag cggccgctcgagtctagagggcccgtttaaac ccgctgatcagcctcgactgtgccttctagtt gccagccatctgttgtttgcccctcccccgtg ccttccttgaccctggaaggtgccactcccac tgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcat cgcattgtctgagtaggtgtcattctattctgggg ggtggggtggggcaggacagcaaggggga ggattgggaagacaatagcaggcatgctggg gatgcggtgggctctatggcttctgaggcggaa agaaccagctggggctctagggggtatcccca cgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcg ggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctac acttgccagcgccctagcgcccgctcctttcg ctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctt tccccgtcaagctctaaatcgggggctcccttta gggttccgatttagtgctttacggcacctcgacc ccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgta gtgggccatcgccctgatagacggtttttcgcc ctttgacgttggagtccacgttctttaatagtg gactcttgttccaaactggaacaacactcaacc ctatctcggtctattcttttgatttataagggatttt gccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctg atttaacaaaaatttaacgcgaattaattctgt ggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccc caggctccccagcaggcagaagtatgcaaag catgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtgg aaagtccccaggctccccagcaggcagaagt atgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaac catagtcccgcccctaactccgcccatcccgc ccctaactccgcccagttccgcccattctccgcc ccatggctgactaattttttttatttatgcagaggc cgaggccgcctctgcctctgagctattccagaa gtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttg caaaaagctcccgggagcttgtatatccattttc ggatctgatcaagagacaggatgaggatcgttt cgcatgattgaacaagatggattgcacgcagg ttctccggccgcttgggtggagaggctattcggc tatgactgggcacaacagacaatcggctgctct gatgccgccgtgttccggctgtcagcgcagggg cgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccgg tgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcg cggctatcgtggctggccacgacgggcgttcct tgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcg ggaagggactggctgctattgggcgaagtgcc ggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctg ccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatg cggcggctgcatacgcttgatccggctacctgc ccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcg agcgagcacgtactcggatggaagccggtct tgtcgatcaggatgatctggacgaagagcat caggggctcgcgccagccgaactgttcgcca ggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgagg atctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttg ccgaatatcatggtggaaaatggccgctttt ctggattcatcgactgtggccggctgggtgt ggcggaccgctatcaggacatagcgttggct acccgtgatattgctgaagagcttggcggcg aatgggctgaccgcttcctcgtgctttacgg tatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgcc ttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcg ggactctggggttcgaaatgaccgaccaag cgacgcccaacctgccatcacgagatttcgat tccaccgccgccttctatgaaaggttgggctt cggaatcgttttccgggacgccggctggatga tcctccagcgcggggatctcatgctggagt tcttcgcccaccccaacttgtttattgcagctta taatggttacaaataaagcaatagcatcacaa atttcacaaataaagcatttttttcactgcatt ctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtat cttatcatgtctgtataccgtcgacctctagct agagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttc ctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacac aacatacgagccggaagcataaagtgtaaag cctggggtgcctaatgagtgagctaactcacat taattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtc gggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaa tcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcg tattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactc gctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggt atcagctcactcaaaggcggtaatacggttatc cacagaatcaggggataacgcaggaaagaa catgtgagcaaaaggccagcaaaaggccag gaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttt tccataggctccgcccccctgacgagcatcac aaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaa acccgacaggactataaagataccaggcgtt tccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgtt ccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcc tttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcat agctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtag gtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaa ccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatcc ggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaag acacgacttatcgccactggcagcagccactg gtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggc ggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaact acggctacactagaagaacagtatttggtatc tgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaa aagagttggtagctcttgatccggcaaacaaa ccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgca agcagcagattacgcgcagaaaaaaaggat ctcaagaagatcctttgatcttttctacggggt ctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaa gggattttggtcatgagattatcaaaaaggatct tcacctagatccttttaaattaaaaatgaagtt ttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaactt ggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgagg cacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatcca tagttgcctgactccccgtcgtgtagataactac gatacgggagggcttaccatctggccccagtg ctgcaatgataccgcgagacccacgctcacc ggctccagatttatcagcaataaaccagccag ccggaagggccgagcgcagaagtggtcctg caactttatccgcctccatccagtctattaattgtt gccgggaagctagagtaagtagttcgccagtt aatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacag gcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatgg cttcattcagctccggttcccaacgatcaaggc gagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaag cggttagctccttcggtcctccgatcgttgtca gaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggt tatggcagcactgcataattctcttactgtcatg ccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagta ctcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcg gcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacg ggataataccgcgccacatagcagaactttaa aagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggc gaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagat ccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaact gatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttc tgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgc cgcaaaaaagggaataagggcgacacgga aatgttgaatactcatactcttcctttttcaat attattgaagcatttatcagggttattgtc tcatgagcggatacatatttgaatgtattt agaaaaataaacaaataggggttccgcgca catttccccgaaaagtgccacctgacgtc | ||
| LgBiT | Promega | N3030 | |
| penicillin Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Pierce Protein G Magnetic Beads | Thermo Fisher Scientific | 88848 | |
| PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent | Signagen | SL100688.5 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab | SinoBiological | 40592-MM57 | |
| Synergy Mx Microplate Reader | BioTek | 96-well plate reader luminometer | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 2520056 | 0.25% |
References
- Ullah, H., Ullah, A., Gul, A., Mousavi, T., Khan, M. W. Novel coronavirus 2019 (COVID-19) pandemic outbreak: A comprehensive review of the current literature. Vacunas. , (2020).
- Coronavirus update (Live). Worldometer Available from: https://www.worldometers.info/coronavirus/ (2021)
- Cacciapaglia, G., Cot, C., Sannino, F. Second wave COVID-19 pandemics in Europe: a temporal playbook. Scientific Reports. 10 (1), 15514 (2020).
- COVID-19 vaccines. World Health Organization Available from: https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/covid-19-vaccines (2021)
- Hueston, L., et al. The antibody response to SARS-CoV-2 infection. Open Forum Infectious Diseases. 7 (9), (2020).
- Lan, J., et al. Structure of the SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain bound to the ACE2 receptor. Nature. 581 (7807), 215-220 (2020).
- Azad, T., et al. Implications for SARS-CoV-2 vaccine design: fusion of Spike glycoprotein transmembrane domain to receptor-binding domain induces trimerization. Membranes. 10 (9), 215 (2020).
- Piccoli, L., et al. Mapping neutralizing and immunodominant sites on the SARS-CoV-2 Spike receptor-binding domain by structure-guided high-resolution serology. Cell. 183 (4), 1024-1042 (2020).
- Premkumar, L., et al. The receptor-binding domain of the viral spike protein is an immunodominant and highly specific target of antibodies in SARS-CoV-2 patients. Science Immunology. 5 (48), (2020).
- Walls, A. C., et al. Elicitation of potent neutralizing antibody responses by designed protein nanoparticle vaccines for SARS-CoV-2. Cell. 183 (5), 1367-1382 (2020).
- Azad, T. Nanoluciferase complementation-based biosensor reveals the importance of N- linked glycosylation of SARS-CoV-2 Spike for viral entry. Mol Ther. , 0074-0075 (2021).
- Bastos, M. L., et al. Diagnostic accuracy of serological tests for covid-19: systematic review and meta-analysis. BMJ. 370, 2516 (2020).
- Bioluminescent Reporters | Reporter Gene Applications | An Introduction to Reporter Genes. Promega Available from: https://www.promega.ca/resources/guides/cell-biology/bioluminescent-reporters/#references-6d127eb8-eeae-40b7-86e9-fe300545e8fa (2021)
- Fleiss, A., Sarkisyan, K. S. A brief review of bioluminescent systems. Current Genetics. 65 (4), 877-882 (2019).
- Nouri, K., et al. A kinome-wide screen using a NanoLuc LATS luminescent biosensor identifies ALK as a novel regulator of the Hippo pathway in tumorigenesis and immune evasion. The FASEB Journal. 33 (11), 12487-12499 (2019).
- Boute, N., et al. NanoLuc Luciferase – a multifunctional tool for high throughput antibody screening. Frontiers in Pharmacology. 7, 27 (2016).
- Nouri, K., et al. Identification of celastrol as a novel YAP-TEAD inhibitor for cancer therapy by high throughput screening with ultrasensitive YAP/TAZ-TEAD biosensors. Cancers. 11 (10), 1596 (2019).
- Azad, T., et al. SARS-CoV-2 S1 NanoBiT: A nanoluciferase complementation-based biosensor to rapidly probe SARS-CoV-2 receptor recognition. Biosensors and Bioelectronics. 180, 113122 (2021).
- Brown, E. E. F., et al. Characterization of critical determinants of ACE2-SARS CoV-2 RBD interaction. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2268 (2021).
- Azad, T., et al. A gain-of-functional screen identifies the Hippo pathway as a central mediator of receptor tyrosine kinases during tumorigenesis. Oncogene. 39 (2), 334-355 (2020).
- Schwinn, M. K., et al. CRISPR-Mediated tagging of endogenous proteins with a luminescent peptide. ACS Chemical Biology. 13 (2), 467-474 (2018).
- Azad, T., et al. A high-throughput NanoBiT-based serological assay detects SARS-CoV-2 seroconversion. Nanomaterials. 11 (3), 807 (2021).
