白细胞消除过滤器衍生的CD34 +细胞作为研究巨核细胞分化和血小板形成的细胞来源
Summary
该协议详细描述了获得白细胞衍生的CD34 +造血祖细胞及其 体外 分化和成熟为能够释放培养基中血小板的含丙酸盐的巨核细胞所涉及的所有步骤。该程序可用于深入分析控制巨核细胞生成的细胞和分子机制。
Abstract
人造血祖细胞 的体外 扩增和分化为能够伸长丙酸盐和释放血小板的巨核细胞，可以深入研究血小板生物发生的机制。现有的培养方案主要基于来自骨髓或脐带血的造血祖细胞，这引发了许多伦理、技术和经济问题。如果已经有可用的方案可以从外周血中获取CD34细胞，那么本手稿提出了一种简单而优化的方案，用于从血液中心现成的白细胞消除过滤器中获取CD34 +细胞。这些细胞是从白细胞破灭过滤器中分离出来的，用于制备输血产品，相当于八次献血。这些过滤器应该被丢弃。描述了从这些过滤器中收集鉴定为CD34 +细胞的造血祖细胞的详细程序。还详细介绍了在讨论其表型进化的同时获得延伸丙酸盐的成熟巨核细胞的方法。最后，该协议提出了一种经过校准的移液方法，以有效地释放在形态学和功能上与天然血小板相似的血小板。该协议可以作为评估在过程的各个步骤中起作用的药理学化合物的基础，以剖析潜在的机制并接近 体内 血小板产量。
Introduction
血小板来自专门的大多倍体细胞，即巨核细胞（MK），其起源于称为巨核细胞（MKP）的恒定和微调的生产过程。该过程的顶点是造血干细胞，它们与骨髓环境（细胞因子，转录因子，造血龛）接触，将能够增殖并分化成能够致力于巨核细胞通路的造血祖细胞（HP），从而产生未成熟的MKs1。在各种细胞因子的影响下，特别是血小板生成素（TPO），这是MKP的主要细胞因子;然后，MK将经历两个主要的成熟阶段：内膜分裂和分界膜（DMS）的发展。然后，这种完全成熟的MK出现在正弦血管附近，在该血管中它可以发射细胞质延伸，即丙酸盐，其将在血流下释放并随后重塑为功能性血小板2。1994年TPO的克隆3 通过加速体 外 培养技术的发展，促进了HP分化和MK成熟的MKP研究。
有许多影响血小板的病理，无论是在血小板数量（增加或减少）和功能方面4，5。能够从人类HP体外概括MKP可以提高对这一过程背后的分子和细胞机制的理解，并最终改善患者的治疗管理。
各种来源的人HP是合适的：脐带血，骨髓和外周血6，7，8。与从脐带血或骨髓中恢复相比，从外周血中采集HP引起的后勤和伦理问题更少。HP可以从白细胞分离术或黄褐色外套中恢复，但这些来源很昂贵，并且在血液中心并不总是可用的。其他方案，更便宜，更容易执行，允许直接回收人外周血单核细胞（PBMC），而无需事先CD34驱动的分离4，8。然而，这种方法对巨核细胞的纯度并不令人满意，建议从PBMC中选择CD34 +细胞以最佳分化为MK。这导致我们从白细胞还原过滤器（LRF）中实施了HP纯化，该过滤器通常用于血库中以去除白细胞，从而避免不良免疫反应9。事实上，自1998年以来，法国的血小板浓缩物已被自动白细胞化。在此过程结束时，LRF被丢弃，所有保留在LRF中的细胞都被破坏。因此，LRF中的细胞很容易获得，无需额外费用。LRF具有接近白细胞分离术或黄褐色外套获得的细胞含量，特别是其CD34 + HP的组成使它们成为非常有吸引力的来源10。LRF作为人类HP来源已被证明可以为细胞提供完整的功能容量11。这种来源的优点是丰富且价格合理，可用于实验室研究。在此背景下，本文依次描述了：i）从LRF中提取和选择CD34+ HP;ii）两阶段优化培养，其概括了HP对巨核细胞途径的承诺以及能够释放丙酸盐的MK的成熟;iii）从这些MK中有效释放血小板的方法;和iv）表型MK和培养血小板的程序。
Protocol
Representative Results
Discussion
该协议描述了一种生产MK的方法，该MK能够从血液衍生的HP中释放丙酸盐并从培养基中释放血小板。HP从LRF（血库的副产品）中获得，用于从细胞血液制品中去除污染的白细胞并避免不良反应。虽然这种方法相对简单，但有几点值得特别注意。
必须轻柔地在密度梯度培养基上沉积细胞悬浮液（步骤1.3.1）以避免混合（红色含量）。如果未仔细执行此步骤，则协议应在此点停止。?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了ANR（国家研究机构）Grant ANR-17-CE14-0001-1的支持。
Materials
| 7-AAD | Biolegend | 558819 | |
| ACD | EFS-Alsace | NA | |
| Anti-CD34-PE | Miltenyi biotec | 130-081-002 | |
| Anti-CD34-PECy7 | eBioscience | 25-0349-42 | |
| Anti-CD41-Alexa Fluor 488 | Biolegend | 303724 | |
| Anti-CD42a-PE | BD Bioscience | 559919 | |
| Apyrase | EFS-Alsace | NA | |
| BD Trucount Tubes | BD Bioscience | 340334 | |
| CD34 MicroBead Kit UltraPure, human | Miltenyi biotec | 130-100-453 | |
| Centrifuge | Heraeus | Megafuge 1.OR | Or equivalent material |
| Compteur ADAM | DiagitalBio | NA | Or equivalent material |
| Cryotubes | Dutscher | 55002 | Or equivalent material |
| Dextran from leuconostoc spp | Sigma | 31392-50g | Or equivalent material |
| DMSO Hybri-max | Sigma | D2650 | |
| EDTA 0.5 M | Gibco | 15575-039 | |
| Eppendorf 1,5 mL | Dutscher | 616201 | Or equivalent material |
| Filtration unit Steriflip PVDF | Merck Millipore Ltd | SE1M179M6 | |
| Flow Cytometer | BD Bioscience | Fortessa | |
| Human LDL | Stemcell technologies | #02698 | |
| ILOMEDINE 0,1 mg/1 mL | Bayer | MA038EX | |
| Inserts | Fenwal | R4R1401 | Or equivalent material |
| Laminar flow hood | Holten | NA | Archived product |
| LS Columms | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Lymphoprep | Stemcell | 7861 | |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | |
| PBS (-) | Life Technologies | 14190-169 | Or equivalent material |
| PGi2 | Sigma | P6188 | |
| Poches de transferts 600ml | Macopharma | VSE4001XA | |
| Pre-Separation Filters (30µm) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| StemRegenin 1 (SR1) | Stemcell technologies | #72344 | |
| StemSpan Expansion Supplement (100x) | Stemcell technologies | #02696 | |
| StemSpan-SFEM | Stemcell technologies | #09650 | |
| Stericup Durapore 0,22µm PVDF | Merck Millipore Ltd | SCGVU05RE | |
| SVF Hyclone | Thermos scientific | SH3007103 | |
| Syringues 30 mL | Terumo | SS*30ESE1 | Or equivalent material |
| Syringe filters Millex 0,22µM PVDF | Merck Millipore Ltd | SLGV033RB | |
| TPO | Stemcell technologies | #02822 | |
| Tubes 50 mL | Sarstedt | 62.548.004 PP | Or equivalent material |
| Tubes 15 mL | Sarstedt | 62.554.001 PP | Or equivalent material |
| Tubulures | B Braun | 4055137 | Or equivalent material |
References
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