Ce protocole décrit en détail toutes les étapes impliquées dans l’obtention de progéniteurs hématopoïétiques CD34+ dérivés de leucofiltres et leur différenciation et maturation in vitro en mégacaryocytes proplaquettaires capables de libérer des plaquettes dans le milieu de culture. Cette procédure est utile pour l’analyse approfondie des mécanismes cellulaires et moléculaires contrôlant la mégacaryopoïèse.
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Article de méthode
Filtres de leucodeplétion Des cellules CD34+ dérivées comme source cellulaire pour étudier la différenciation des mégacaryocytes et la formation de plaquettes
Dans cet article
Résumé
Résumé
L’expansion et la différenciation in vitro des progéniteurs hématopoïétiques humains en mégacaryocytes capables d’allonger les proplaquettaires et de libérer des plaquettes permettent une étude approfondie des mécanismes sous-jacents à la biogenèse plaquettaire. Les protocoles de culture disponibles sont principalement basés sur des progéniteurs hématopoïétiques dérivés de la moelle osseuse ou du sang de cordon ombilical soulevant un certain nombre de préoccupations éthiques, techniques et économiques. S’il existe déjà des protocoles disponibles pour obtenir des cellules CD34 à partir du sang périphérique, ce manuscrit propose un protocole simple et optimisé pour obtenir des cellules CD34+ à partir de filtres leucodéplétion facilement disponibles dans les centres sanguins. Ces cellules sont isolées à partir de filtres de leucodeplétion utilisés dans la préparation de produits de transfusion sanguine, correspondant à huit dons de sang. Ces filtres sont destinés à être jetés. Une procédure détaillée pour recueillir les progéniteurs hématopoïétiques identifiés comme des cellules CD34+ à partir de ces filtres est décrite. La méthode pour obtenir des mégacaryocytes matures prolongeant les proplaquettaires tout en discutant de leur évolution phénotypique est également détaillée. Enfin, le protocole présente une méthode de pipetage calibrée, pour libérer efficacement des plaquettes morphologiquement et fonctionnellement similaires aux plaquettes natives. Ce protocole peut servir de base à l’évaluation des composés pharmacologiques agissant à différentes étapes du processus pour disséquer les mécanismes sous-jacents et approcher les rendements plaquettaires in vivo.
Introduction
Les plaquettes sanguines proviennent de grandes cellules polyploïdes spécialisées, les mégacaryocytes (MK), qui proviennent d’un processus de production constant et affiné connu sous le nom de mégacarylopoïèse (MKP). Au sommet de ce processus se trouvent les cellules souches hématopoïétiques qui, au contact de l’environnement de la moelle osseuse (cytokines, facteurs de transcription, niche hématopoïétique), seront capables de proliférer et de se différencier en progéniteurs hématopoïétiques (HP) capables de s’engager vers la voie mégacaryocytaire, donnant naissance à des MK immatures1. Sous l’influence de diverses cytokines, et en particulier ....
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Protocole
Des échantillons humains témoins ont été obtenus auprès de donneurs de sang volontaires qui ont donné leur consentement éclairé écrit recruté par le centre de transfusion sanguine où la recherche a été effectuée (Etablissement Français du Sang-Grand Est). Toutes les procédures ont été enregistrées et approuvées par le ministère Français de l’Enseignement supérieur et de la Recherche et enregistrées sous le numéro AC_2015_2371.Les donneurs ont donné leur approbation dans le formulaire de consentement CODHECO numéro AC- 2008 - 562, afin que les échantillons soient utilisés à des fins de recherche. Des études humaines ont été réalisées conformément à la déclaration d’Hel....
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Résultats
Extraction et sélection de cellules CD34+ à partir de LRF
Ici, la méthode, dérivée de Peytour et al.9, décrit l’extraction et la sélection de cellules CD34+ à partir de LRF rejetées disponibles dans les banques de sang après l’élimination des leucocytes. À la suite de la procédure de rinçage arrière, habituellement 1,03 x10 9 ± 2,45 x10 8 cellules/LRF (Moyenne±SEM; n = 155) sont récupérés avec une viabilité de 94,88 ± 0,10 %.......
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Discussion
Ce protocole décrit une méthode de production de MK capable d’émettre des proplaquettaires à partir de HP d’origine sanguine et de libérer des plaquettes du milieu de culture. Les HP sont obtenus à partir de LRF, un sous-produit des banques de sang, utilisé pour éliminer les leucocytes contaminants des produits sanguins cellulaires et éviter les effets indésirables. Bien que cette méthode soit relativement simple, quelques points méritent une attention particulière.
Le dépôt de la suspension c.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par la subvention ANR (Agence Nationale de la Recherche) ANR- 17-CE14-0001-1.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 7-AAD | Biolegend | 558819 | |
| ACD | EFS-Alsace | NA | |
| Anti-CD34-PE ; | Miltenyi biotec | 130-081-002 | |
| Anti-CD34-PECy7 | eBioscience | 25-0349-42 | |
| Anti-CD41-Alexa Fluor 488 | Biolegend | 303724 | |
| Anti-CD42a-PE | BD Bioscience | 559919 | |
| Apyrase | EFS-Alsace | NA | |
| BD Trucount Tubes | BD Bioscience | 340334 | |
| CD34 MicroBead Kit UltraPure, humain ; | Miltenyi biotec | 130-100-453 | |
| Centrifuge | Heraeus | Megafuge 1.OR | Ou matériau équivalent |
| Compteur ADAM ; | DiagitalBio | NA | Ou matériau équivalent |
| Cryotubes | Dutscher | 55002 | Ou matériau équivalent |
| Dextran de leuconostoc spp ; | Sigma | 31392-50g | Ou matériau équivalent |
| DMSO Hybri-max ; | Sigma | D2650 | |
| EDTA 0,5 M ; | Gibco | 15575-039 | |
| Eppendorf 1,5 mL ; | Dutscher | 616201 | Ou matériau équivalent |
| Unité de filtration Steriflip PVDF | Merck Millipore Ltd | SE1M179M6 | |
| Cytomètre en flux | BD Bioscience | Fortessa | |
| Human LDL | Stemcell technologies | #02698 | |
| ILOMEDINE 0,1 mg/1 mL | Bayer | MA038EX | |
| Inserts | Fenwal | R4R1401 | Ou matériau équivalent |
| Hotte à flux laminaire ; | Holten | NA | Produit archivé |
| LS Columms ; | Miltenyi Biotec | 130-042-401 ; | |
| Lymphoprep | Stemcell | 7861 | |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | |
| PBS (-) | Life Technologies | 14190-169 ; | Ou matériau équivalent |
| PGi2 | Sigma | P6188 | |
| Poches de transferts 600ml ; | Macopharma | VSE4001XA | |
| filtres de pré-séparation (30µ ; m) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| StemRegenin 1 (SR1) | Technologies des cellules souches | #72344 | |
| Supplément d’expansion StemSpan (100x) | Technologies des cellules souches | #02696 | |
| StemSpan-SFEM ; | Stemcell technologies | #09650 | |
| Stericup Durapore 0,22µ ; m PVDF | Merck Millipore Ltd | SCGVU05RE | |
| SVF Hyclone ; | Thermos scientifique | SH3007103 | |
| Syringues 30 mL ; | Terumo | SS*30ESE1 | Ou matériau équivalent |
| Filtres à seringue Millex 0,22µ ; M PVDF | Merck Millipore Ltd | SLGV033RB | |
| TPO | Stemcell technologies | #02822 | |
| Tubes 50 mL | Sarstedt | 62.548.004 PP | Ou matériau équivalent |
| Tubes 15 mL ; | Sarstedt | 62.554.001 | PP Ou matière équivalente |
| Tubulures | B Braun | 4055137 | Ou matière équivalente |
Références
- Deutsch, V. R., Tomer, A. Megakaryocyte development and platelet production. British Journal of Haematology. 134 (5), 453-466 (2006).
- Lefrancais, E., et al. The lung is a site of platelet biogenesis and a reservoir for haematopoietic progenitors. Natu....
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Réimpressions et autorisations
