Leukodepletiefilters-afgeleide CD34 + -cellen als een celbron om megakaryocytendifferentiatie en bloedplaatjesvorming te bestuderen
Summary
Dit protocol beschrijft in detail alle stappen die betrokken zijn bij het verkrijgen van leukofilter-afgeleide CD34 + hematopoietische voorlopers en hun in vitro differentiatie en rijping tot proplatelet-dragende megakaryocyten die in staat zijn om bloedplaatjes in het kweekmedium vrij te geven. Deze procedure is nuttig voor diepgaande analyse van cellulaire en moleculaire mechanismen die megakaryopoiese beheersen.
Abstract
De in vitro expansie en differentiatie van menselijke hematopoietische voorlopers in megakaryocyten die in staat zijn om voorplaatjes te verlengen en bloedplaatjes vrij te geven, maakt een diepgaande studie mogelijk van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de biogenese van bloedplaatjes. Beschikbare kweekprotocollen zijn meestal gebaseerd op hematopoëtische voorlopercellen afgeleid van beenmerg- of navelstrengbloed die een aantal ethische, technische en economische zorgen oproepen. Als er al protocollen beschikbaar zijn voor het verkrijgen van CD34-cellen uit perifeer bloed, stelt dit manuscript een eenvoudig en geoptimaliseerd protocol voor voor het verkrijgen van CD34 + -cellen uit leukodepletiefilters die direct beschikbaar zijn in bloedcentra. Deze cellen worden geïsoleerd uit leukodepletiefilters die worden gebruikt bij de bereiding van bloedtransfusieproducten, wat overeenkomt met acht bloeddonaties. Deze filters zijn bedoeld om weggegooid te worden. Een gedetailleerde procedure om hematopoëtische voorlopercellen geïdentificeerd als CD34+ cellen uit deze filters te verzamelen, wordt beschreven. De methode om volwassen megakaryocyten te verkrijgen die proplatelets verlengen terwijl hun fenotypische evolutie wordt besproken, is ook gedetailleerd. Ten slotte presenteert het protocol een gekalibreerde pipetteermethode, om bloedplaatjes die morfologisch en functioneel vergelijkbaar zijn met inheemse bloedplaatjes efficiënt vrij te geven. Dit protocol kan dienen als basis voor het evalueren van farmacologische verbindingen die in verschillende stappen van het proces werken om de onderliggende mechanismen te ontleden en de in vivo bloedplaatjesopbrengsten te benaderen.
Introduction
Bloedplaatjes zijn afkomstig van gespecialiseerde grote polyploïde cellen, de megakaryocyten (MK), die afkomstig zijn van een constant en nauwkeurig afgestemd productieproces dat bekend staat als megakaryopoiese (MKP). Aan de top van dit proces bevinden zich hematopoëtische stamcellen die, in contact met de beenmergomgeving (cytokines, transcriptiefactoren, hematopoietische niche), in staat zullen zijn om zich te vermenigvuldigen en te differentiëren in hematopoëtische voorlopers (HP) die zich kunnen committeren aan de megakaryocytische route, wat aanleiding geeft tot onrijpe MKs1. Onder invloed van verschillende cytokines, en in het bijzonder trombopoietine (TPO), het belangrijkste cytokine van MKP; de MK zal dan twee belangrijke stadia van rijping ondergaan: endomitose en de ontwikkeling van demarcatiemembranen (DMS). Deze volledig volwassen MK verschijnt dan dicht bij een sinusoïde vat waarin het cytoplasmatische extensies kan uitzenden, de proplatelets, die onder de bloedstroom worden vrijgegeven en vervolgens worden omgevormd tot functionele bloedplaatjes2. Het klonen van TPO in 19943 gaf een impuls aan de studie van MKP door de ontwikkeling van in vitro kweektechnieken te versnellen die HP-differentiatie en MK-rijping mogelijk maakten.
Er zijn veel pathologieën die bloedplaatjes beïnvloeden, zowel in termen van bloedplaatjesaantal (toename of afname) als functie4,5. In staat zijn om MKP in vitro van menselijke HP samen te vatten, zou het begrip van de moleculaire en cellulaire mechanismen die ten grondslag liggen aan dit proces en uiteindelijk het therapeutisch beheer van patiënten kunnen verbeteren.
Verschillende bronnen van menselijk HP zijn geschikt: navelstrengbloed, beenmerg en perifeer bloed6,7,8. Het oogsten van HP uit perifeer bloed levert minder logistieke en ethische problemen op dan hun herstel uit navelstrengbloed of het beenmerg. HP kan worden hersteld van leukaferese of buffy coat, maar deze bronnen zijn duur en niet altijd beschikbaar in bloedcentra. Andere protocollen, minder duur en gemakkelijker uit te voeren, maken direct herstel van menselijke perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC’s) mogelijk zonder de noodzaak van voorafgaande CD34-gestuurde isolatie4,8. De zuiverheid van megakaryocyten is echter niet bevredigend met deze methode en een selectie van CD34+ cellen uit PBMC wordt aanbevolen voor optimale differentiatie in MK. Dit bracht ons ertoe om een HP-zuivering van leukoreductiefilters (LRF) te implementeren, routinematig gebruikt in bloedbanken om witte bloedcellen te verwijderen en zo nadelige immunologische reacties te voorkomen9. Sinds 1998 zijn bloedplaatjesconcentraten in Frankrijk zelfs automatisch leukodeputten. Aan het einde van dit proces worden LRF weggegooid en worden alle cellen die in de LRF worden vastgehouden, vernietigd. Cellen in LRF’s zijn daarom direct beschikbaar zonder extra kosten. LRF’s hebben een cellulair gehalte dat dicht in de buurt komt van dat verkregen door leukaferese of in buffy coats, met name in hun samenstelling van CD34 + HP waardoor ze een opmerkelijk aantrekkelijke bronzijn 10. Van LRF als menselijke HP-bron is al aangetoond dat het cellen voorziet van intacte functionele capaciteiten11. Deze bron heeft het voordeel dat het overvloedig en betaalbaar is voor laboratoriumonderzoek. In dit verband beschrijft dit artikel achtereenvolgens: i) de extractie en selectie van CD34+ HP uit LPF’s; ii) een tweefasige geoptimaliseerde cultuur, die de inzet van HP in de megakaryocytische route en de rijping van MK die proplatelets kan uitzenden, samenvat; iii) een methode voor het efficiënt vrijgeven van bloedplaatjes uit deze MK; en iv) een procedure voor fenotypering van MK en gekweekte bloedplaatjes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol beschrijft een methode voor het produceren van MK die in staat is om proplatelets uit bloedafname HP uit te zenden en bloedplaatjes uit het kweekmedium vrij te geven. HP worden verkregen uit LRF, een bijproduct van de bloedbanken, gebruikt om besmettelijk leukocyten uit cellulaire bloedproducten te verwijderen en bijwerkingen te voorkomen. Hoewel deze methode relatief eenvoudig is, verdienen een paar punten speciale aandacht.
De afzetting van de celsuspensie op het medium met dich…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk is ondersteund door ANR (Agence National de la Recherche) Grant ANR- 17-CE14-0001-1.
Materials
| 7-AAD | Biolegend | 558819 | |
| ACD | EFS-Alsace | NA | |
| Anti-CD34-PE | Miltenyi biotec | 130-081-002 | |
| Anti-CD34-PECy7 | eBioscience | 25-0349-42 | |
| Anti-CD41-Alexa Fluor 488 | Biolegend | 303724 | |
| Anti-CD42a-PE | BD Bioscience | 559919 | |
| Apyrase | EFS-Alsace | NA | |
| BD Trucount Tubes | BD Bioscience | 340334 | |
| CD34 MicroBead Kit UltraPure, human | Miltenyi biotec | 130-100-453 | |
| Centrifuge | Heraeus | Megafuge 1.OR | Or equivalent material |
| Compteur ADAM | DiagitalBio | NA | Or equivalent material |
| Cryotubes | Dutscher | 55002 | Or equivalent material |
| Dextran from leuconostoc spp | Sigma | 31392-50g | Or equivalent material |
| DMSO Hybri-max | Sigma | D2650 | |
| EDTA 0.5 M | Gibco | 15575-039 | |
| Eppendorf 1,5 mL | Dutscher | 616201 | Or equivalent material |
| Filtration unit Steriflip PVDF | Merck Millipore Ltd | SE1M179M6 | |
| Flow Cytometer | BD Bioscience | Fortessa | |
| Human LDL | Stemcell technologies | #02698 | |
| ILOMEDINE 0,1 mg/1 mL | Bayer | MA038EX | |
| Inserts | Fenwal | R4R1401 | Or equivalent material |
| Laminar flow hood | Holten | NA | Archived product |
| LS Columms | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Lymphoprep | Stemcell | 7861 | |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | |
| PBS (-) | Life Technologies | 14190-169 | Or equivalent material |
| PGi2 | Sigma | P6188 | |
| Poches de transferts 600ml | Macopharma | VSE4001XA | |
| Pre-Separation Filters (30µm) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| StemRegenin 1 (SR1) | Stemcell technologies | #72344 | |
| StemSpan Expansion Supplement (100x) | Stemcell technologies | #02696 | |
| StemSpan-SFEM | Stemcell technologies | #09650 | |
| Stericup Durapore 0,22µm PVDF | Merck Millipore Ltd | SCGVU05RE | |
| SVF Hyclone | Thermos scientific | SH3007103 | |
| Syringues 30 mL | Terumo | SS*30ESE1 | Or equivalent material |
| Syringe filters Millex 0,22µM PVDF | Merck Millipore Ltd | SLGV033RB | |
| TPO | Stemcell technologies | #02822 | |
| Tubes 50 mL | Sarstedt | 62.548.004 PP | Or equivalent material |
| Tubes 15 mL | Sarstedt | 62.554.001 PP | Or equivalent material |
| Tubulures | B Braun | 4055137 | Or equivalent material |
References
- Deutsch, V. R., Tomer, A. Megakaryocyte development and platelet production. British Journal of Haematology. 134 (5), 453-466 (2006).
- Lefrancais, E., et al. The lung is a site of platelet biogenesis and a reservoir for haematopoietic progenitors. Nature. 544 (7648), 105-109 (2017).
- de Sauvage, F. J., et al. Stimulation of megakaryocytopoiesis and thrombopoiesis by the c-Mpl ligand. Nature. 369 (6481), 533-538 (1994).
- Almomani, M. H., Mangla, A. . StatPearls. , (2020).
- Strassel, C., Hechler, B., Bull, A., Gachet, C., Lanza, F. Studies of mice lacking the GPIb-V-IX complex question the role of this receptor in atherosclerosis. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 7 (11), 1935-1938 (2009).
- Delalat, B., et al. Isolation and ex vivo expansion of human umbilical cord blood-derived CD34+ stem cells and their cotransplantation with or without mesenchymal stem cells. Hematology. 14 (3), 125-132 (2009).
- Yin, T., Li, L. The stem cell niches in bone. The Journal of Clinical Investigation. 116 (5), 1195-1201 (2006).
- Salunkhe, V., Papadopoulos, P., Gutiérrez, L. Culture of megakaryocytes from human peripheral blood mononuclear cells. Bio-protocol. 5 (21), 1639 (2015).
- Peytour, Y., Villacreces, A., Chevaleyre, J., Ivanovic, Z., Praloran, V. Discarded leukoreduction filters: a new source of stem cells for research, cell engineering and therapy. Stem Cell Research. 11 (2), 736-742 (2013).
- Lapostolle, V., et al. Repopulating hematopoietic stem cells from steady-state blood before and after ex vivo culture are enriched in the CD34(+)CD133(+)CXCR4(low) fraction. Haematologica. 103 (10), 1604-1615 (2018).
- Ivanovic, Z., et al. Whole-blood leuko-depletion filters as a source of CD 34+ progenitors potentially usable in cell therapy. Transfusion. 46 (1), 118-125 (2006).
- Strassel, C., et al. Aryl hydrocarbon receptor-dependent enrichment of a megakaryocytic precursor with a high potential to produce proplatelets. Blood. 127 (18), 2231-2240 (2016).
- Do Sacramento, V., et al. Functional properties of human platelets derived in vitro from CD34(+) cells. Scientific Reports. 10 (1), 914 (2020).
- Blin, A., et al. Microfluidic model of the platelet-generating organ: beyond bone marrow biomimetics. Scientific Reports. 6, 21700 (2016).
- Ito, Y., et al. Turbulence activates platelet biogenesis to enable clinical scale ex vivo production. Cell. 174 (3), 636-648 (2018).
- Pallotta, I., Lovett, M., Kaplan, D. L., Balduini, A. Three-dimensional system for the in vitro study of megakaryocytes and functional platelet production using silk-based vascular tubes. Tissue Engineering. Part C, Methods. 17 (12), 1223-1232 (2011).
