Leukodepletion Filters-härledda CD34+ celler som cellkälla för att studera megakaryocytdifferentiering och trombocytbildning
Summary
Detta protokoll beskriver i detalj alla steg som är involverade i att erhålla leukofilter-härledda CD34 + hematopoetiska stamceller och deras in vitro differentiering och mognad i proplatelet-bärande megakaryocyter som kan släppa trombocyter i odlingsmediet. Denna procedur är användbar för djupgående analys av cellulära och molekylära mekanismer som styr megakaryopoiesis.
Abstract
In vitro expansion och differentiering av mänskliga hematopoetiska stamceller till megakaryocyter som kan förlänga proplatelets och frigöra trombocyter möjliggör en djupgående studie av mekanismerna bakom trombocyt biogenesis. Tillgängliga kultur protokoll är mestadels baserade på hematopoetiska stamceller härrör från benmärg eller sladd blod höja ett antal etiska, tekniska och ekonomiska frågor. Om det redan finns tillgängliga protokoll för att erhålla CD34 celler från perifert blod, föreslår detta manuskript ett enkelt och optimerat protokoll för att erhålla CD34 + celler från leukodepletion filter lätt tillgängliga i blodcentra. Dessa celler isoleras från leukodepletion filter som används vid beredning av blodtransfusion produkter, motsvarande åtta blod donationer. Dessa filter är avsedda att kasseras. En detaljerad procedur för att samla hematopoetiska stamceller identifieras som CD34 + celler från dessa filter beskrivs. Metoden för att erhålla mogna megakaryocyter som förlänger proplatelets medan de diskuterar deras fenotypiska utveckling är också detaljerad. Slutligen presenterar protokollet en kalibrerad pipetteringsmetod, för att effektivt frigöra trombocyter som är morfologiska och funktionellt liknar inhemska. Detta protokoll kan tjäna som grund för utvärdering av farmakologiska föreningar som verkar i olika steg i processen för att dissekera de underliggande mekanismerna och närma sig in vivo trombocytutbyten.
Introduction
Blodplättar kommer från specialiserade stora polyploida celler, megakaryocyterna (MK), som härrör från en konstant och finjusterad produktionsprocess som kallas megakaryopoiesis (MKP). I toppen av denna process är hematopoetiska stamceller som i kontakt med benmärgsmiljön (cytokiner, transkriptionsfaktorer, hematopoetisk nisch), kommer att kunna föröka sig och differentiera sig till hematopoetiska stamceller (HP) som kan engagera sig mot den megakaryocytiska vägen, vilket ger upphov till omogna MKs1. Under påverkan av olika cytokiner, och i synnerhet trombopoietin (TPO), som är den största cytokinen av MKP; MK kommer sedan att genomgå två stora mognadsstadier: endomitosis och utvecklingen av avgränsningsmembran (DMS). Denna fullt mogna MK visas sedan nära ett sinusoidkärl där det kan avge cytoplasmiska förlängningar, proplateletsna, som kommer att släppas under blodflödet och därefter omformas till funktionella trombocyter2. Kloningen av TPO 19943 gav ett uppsving i studien av MKP genom att påskynda utvecklingen av in vitro-kulturtekniker som möjliggör HP-differentiering och MK-mognad.
Det finns många patologier som påverkar blodplättar, både när det gäller trombocytnummer (ökning eller minskning) och funktion4,5. Att kunna rekapitulera MKP in vitro från mänskliga HP kan förbättra förståelsen för de molekylära och cellulära mekanismer som ligger till grund för denna process och i slutändan den terapeutiska förvaltningen av patienter.
Olika källor till mänskliga HP är lämpliga: navelsträngsblod, benmärg och perifert blod6,7,8. Att skörda HP från perifert blod ger mindre logistiska och etiska problem än deras återhämtning från navelsträngsblod eller benmärgen. HP kan återvinnas från leuferes eller buffy coat, men dessa källor är dyra och inte alltid tillgängliga i blodcentra. Andra protokoll, billigare och lättare att utföra, möjliggör direkt återvinning av humana perifera blodmononukleära celler (PBMCs) utan behov av tidigare CD34 driven isolering4,8. Renheten hos megakaryocyter är dock inte tillfredsställande med denna metod och ett urval av CD34 + celler från PBMC rekommenderas för optimal differentiering i MK. Detta ledde oss att implementera en HP-rening från leukoreduction filter (LRF), som rutinmässigt används i blodbanker för att ta bort vita blodkroppar och därmed undvika negativa immunologiska reaktioner9. Sedan 1998 har trombocytkoncentraten automatiskt utarmats i Frankrike. I slutet av denna process kasseras LRF och alla celler som behålls i LRF förstörs. Celler i LRF är därför lätt tillgängliga utan extra kostnad. LRFs har ett cellulärt innehåll nära det som erhålls av leukaferes eller i buffy coats, särskilt i deras sammansättning av CD34 + HP vilket gör dem till en anmärkningsvärt attraktiv källa10. LRF som en mänsklig HP-källa har redan visat sig ge celler med intakt funktionell kapacitet11. Denna källa har fördelen att vara riklig och prisvärd för laboratorieforskning. I detta sammanhang beskriver denna artikel successivt: i) extraktion och val av CD34+ HP från LRF; ii) En tvåfasoptimerad kultur, som sammanfattar HP:s engagemang i den megakaryocytiska vägen och mognaden av MK som kan avge proplatelets. iii) En metod för att effektivt frigöra trombocyter från dessa MK; och iv) ett förfarande för fenotypning av MK och odlade trombocyter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll beskriver en metod för att producera MK som kan avge proplatelets från blod-härledda HP och att frigöra trombocyter från odlingsmediet. HP erhålls från LRF, en biprodukt från blodbankerna, som används för att avlägsna förorenande leukocyter från cellulära blodprodukter och undvika biverkningar. Även om denna metod är relativt enkel förtjänar några punkter särskild uppmärksamhet.
Nedfall av cellupphängningen på densitetsgradientmediet (steg 1.3.1) måste u…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete har fått stöd av ANR (Agence National de la Recherche) Grant ANR- 17-CE14-0001-1.
Materials
| 7-AAD | Biolegend | 558819 | |
| ACD | EFS-Alsace | NA | |
| Anti-CD34-PE | Miltenyi biotec | 130-081-002 | |
| Anti-CD34-PECy7 | eBioscience | 25-0349-42 | |
| Anti-CD41-Alexa Fluor 488 | Biolegend | 303724 | |
| Anti-CD42a-PE | BD Bioscience | 559919 | |
| Apyrase | EFS-Alsace | NA | |
| BD Trucount Tubes | BD Bioscience | 340334 | |
| CD34 MicroBead Kit UltraPure, human | Miltenyi biotec | 130-100-453 | |
| Centrifuge | Heraeus | Megafuge 1.OR | Or equivalent material |
| Compteur ADAM | DiagitalBio | NA | Or equivalent material |
| Cryotubes | Dutscher | 55002 | Or equivalent material |
| Dextran from leuconostoc spp | Sigma | 31392-50g | Or equivalent material |
| DMSO Hybri-max | Sigma | D2650 | |
| EDTA 0.5 M | Gibco | 15575-039 | |
| Eppendorf 1,5 mL | Dutscher | 616201 | Or equivalent material |
| Filtration unit Steriflip PVDF | Merck Millipore Ltd | SE1M179M6 | |
| Flow Cytometer | BD Bioscience | Fortessa | |
| Human LDL | Stemcell technologies | #02698 | |
| ILOMEDINE 0,1 mg/1 mL | Bayer | MA038EX | |
| Inserts | Fenwal | R4R1401 | Or equivalent material |
| Laminar flow hood | Holten | NA | Archived product |
| LS Columms | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Lymphoprep | Stemcell | 7861 | |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | |
| PBS (-) | Life Technologies | 14190-169 | Or equivalent material |
| PGi2 | Sigma | P6188 | |
| Poches de transferts 600ml | Macopharma | VSE4001XA | |
| Pre-Separation Filters (30µm) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| StemRegenin 1 (SR1) | Stemcell technologies | #72344 | |
| StemSpan Expansion Supplement (100x) | Stemcell technologies | #02696 | |
| StemSpan-SFEM | Stemcell technologies | #09650 | |
| Stericup Durapore 0,22µm PVDF | Merck Millipore Ltd | SCGVU05RE | |
| SVF Hyclone | Thermos scientific | SH3007103 | |
| Syringues 30 mL | Terumo | SS*30ESE1 | Or equivalent material |
| Syringe filters Millex 0,22µM PVDF | Merck Millipore Ltd | SLGV033RB | |
| TPO | Stemcell technologies | #02822 | |
| Tubes 50 mL | Sarstedt | 62.548.004 PP | Or equivalent material |
| Tubes 15 mL | Sarstedt | 62.554.001 PP | Or equivalent material |
| Tubulures | B Braun | 4055137 | Or equivalent material |
References
- Deutsch, V. R., Tomer, A. Megakaryocyte development and platelet production. British Journal of Haematology. 134 (5), 453-466 (2006).
- Lefrancais, E., et al. The lung is a site of platelet biogenesis and a reservoir for haematopoietic progenitors. Nature. 544 (7648), 105-109 (2017).
- de Sauvage, F. J., et al. Stimulation of megakaryocytopoiesis and thrombopoiesis by the c-Mpl ligand. Nature. 369 (6481), 533-538 (1994).
- Almomani, M. H., Mangla, A. . StatPearls. , (2020).
- Strassel, C., Hechler, B., Bull, A., Gachet, C., Lanza, F. Studies of mice lacking the GPIb-V-IX complex question the role of this receptor in atherosclerosis. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 7 (11), 1935-1938 (2009).
- Delalat, B., et al. Isolation and ex vivo expansion of human umbilical cord blood-derived CD34+ stem cells and their cotransplantation with or without mesenchymal stem cells. Hematology. 14 (3), 125-132 (2009).
- Yin, T., Li, L. The stem cell niches in bone. The Journal of Clinical Investigation. 116 (5), 1195-1201 (2006).
- Salunkhe, V., Papadopoulos, P., Gutiérrez, L. Culture of megakaryocytes from human peripheral blood mononuclear cells. Bio-protocol. 5 (21), 1639 (2015).
- Peytour, Y., Villacreces, A., Chevaleyre, J., Ivanovic, Z., Praloran, V. Discarded leukoreduction filters: a new source of stem cells for research, cell engineering and therapy. Stem Cell Research. 11 (2), 736-742 (2013).
- Lapostolle, V., et al. Repopulating hematopoietic stem cells from steady-state blood before and after ex vivo culture are enriched in the CD34(+)CD133(+)CXCR4(low) fraction. Haematologica. 103 (10), 1604-1615 (2018).
- Ivanovic, Z., et al. Whole-blood leuko-depletion filters as a source of CD 34+ progenitors potentially usable in cell therapy. Transfusion. 46 (1), 118-125 (2006).
- Strassel, C., et al. Aryl hydrocarbon receptor-dependent enrichment of a megakaryocytic precursor with a high potential to produce proplatelets. Blood. 127 (18), 2231-2240 (2016).
- Do Sacramento, V., et al. Functional properties of human platelets derived in vitro from CD34(+) cells. Scientific Reports. 10 (1), 914 (2020).
- Blin, A., et al. Microfluidic model of the platelet-generating organ: beyond bone marrow biomimetics. Scientific Reports. 6, 21700 (2016).
- Ito, Y., et al. Turbulence activates platelet biogenesis to enable clinical scale ex vivo production. Cell. 174 (3), 636-648 (2018).
- Pallotta, I., Lovett, M., Kaplan, D. L., Balduini, A. Three-dimensional system for the in vitro study of megakaryocytes and functional platelet production using silk-based vascular tubes. Tissue Engineering. Part C, Methods. 17 (12), 1223-1232 (2011).
