Descrito aqui é um método estabelecido para determinar a extensão da restrição do HIV-1 pela proteína inibitória celular SAMHD1. As células U937 da linhagem mieloide humana são transduzidas com um vetor de expressão SAMHD1 co-expressando YFP, diferenciadas e, em seguida, desafiadas com HIV-RFP. O nível de restrição é determinado pela análise de citometria de fluxo.
A proteína 1 contendo domínio α motivo/histidina-aspartato (SAMHD1) inibe a replicação do HIV-1 em células mieloides quiescentes. As células U937 são amplamente utilizadas como um sistema celular conveniente para analisar a atividade SAMHD1 devido a um baixo nível de expressão de RNA SAMHD1, levando à expressão indetectável de proteínas endógenas. Com base em ensaios semelhantes desenvolvidos no laboratório Stoye para caracterizar outros fatores de restrição retroviral, o laboratório Bishop desenvolveu um ensaio de restrição de duas cores para analisar SAMHD1 em células U937. Leucemia murina Partículas semelhantes a vírus expressando SAMHD1, juntamente com YFP expresso a partir de um IRES, são usadas para transduzir células U937. As células são então tratadas com acetato de miristato de forbol para induzir a diferenciação a um fenótipo quiescente. Após a diferenciação, as células são infectadas com partículas semelhantes ao vírus HIV-1 que expressam um repórter fluorescente. Após 48 h, as células são colhidas e analisadas por citometria de fluxo. A proporção de células infectadas pelo HIV na população que expressa SAMHD1 é comparada com a de células de controle interno sem SAMHD1. Essa comparação revela uma taxa de restrição. A expressão de SAMHD1 leva a uma redução de cinco vezes na infecção pelo HIV, correspondendo a uma razão de restrição de 0,2. Nossa recente substituição da RFP pela GFP original como o gene repórter da infecção pelo HIV facilitou a análise da citometria de fluxo.
Este ensaio tem sido utilizado com sucesso para caracterizar o efeito das substituições de aminoácidos na restrição de SAMHD1 por meio da transdução com vírus que codificam proteínas SAMHD1 alteradas, derivadas da mutagênese sítio-dirigida do vetor de expressão. Por exemplo, as substituições de sítio catalítico HD206-7AA mostram um fenótipo de restrição de 1, indicando uma perda de atividade de restrição. Da mesma forma, a suscetibilidade de diferentes vírus testadores pode ser determinada. O ensaio pode ser adaptado para incorporar o efeito do status de diferenciação, estado metabólico e modificadores SAMHD1 para entender melhor a relação entre SAMHD1, estado metabólico celular e restrição viral.
A proteína 1 contendo domínio de α motivo/histidina-aspartato estéril (SAMHD1) impede a replicação do Vírus da Imunodeficiência Humana tipo 1 (HIV-1) em células quiescentes da linhagem mielóide. SAMHD1 bloqueia a replicação através de sua atividade enzimática como uma dNTP trifosfohidrolase, o que resulta em diminuição dos níveis de dNTPs intracelulares. Como resultado, o HIV-1 não pode realizar o processo de transcrição reversa de forma eficiente. Muito progresso foi feito nos poucos anos desde esta observação inicial, particularmente no que diz respeito à contribuição de domínios específicos e aminoácidos para a atividade antiviral do SAMHD1. Esses insights foram feitos usando ensaios bioquímicos, bem como sistemas celulares que imitam o ambiente mieloide quiescente fisiologicamente relevante. As células U9371 são amplamente utilizadas como um sistema de células mieloides conveniente para analisar a atividade SAMHD1. Isto é devido à falta de expressão endógena de SAMHD1, pensado para ser devido a baixos níveis de RNA em comparação com as células que expressam SAMHD1 (uma área de pesquisa em andamento). Aqui, o protocolo descreve a transdução transitória de células U937 com partículas semelhantes a vírus co-expressando SAMHD1 e um repórter de proteína fluorescente amarela (YFP) para examinar o mecanismo de restrição SAMHD1 do HIV-1. Esses ensaios transitórios de citometria de fluxo de duas cores para examinar restrições retrovirais foram desenvolvidos pela primeira vez no laboratório Stoye2 e, desde então, foram adaptados para investigar outros fatores de restrição, incluindo as proteínas do motivo tripartido (TRIM)3. Inspirado por esses ensaios, o laboratório Bishop desenvolveu um ensaio de duas cores para analisar a restrição de SAMHD1 em células U937.
O fluxo de trabalho do experimento é mostrado na Figura 1. Partículas semelhantes ao Vírus da Leucemia Murina (MLV) contendo uma mensagem bi-cistrônica codificando SAMHD1 ao lado de YFP expressa a partir de um IRES são usadas para transduzir células U937. As células são então tratadas com acetato de miristato de forbol (PMA) para induzir a diferenciação a um fenótipo quiescente. As células são infectadas em seguida com partículas semelhantes ao vírus HIV-1 que expressam proteína fluorescente vermelha (RFP). Após 48 h, as células são colhidas e analisadas por citometria de fluxo de duas cores. Este ensaio também é usado com YFP e proteína fluorescente verde (GFP), exigindo menos combinações de filtros padrão para análise de citometria de fluxo. O uso do HIV-RFP permite uma compensação mais direta e, portanto, o ensaio é mais facilmente acessível a usuários de citometria de fluxo menos experientes e alcançável com a maioria dos citômetros.
Durante a análise, a proporção de células infectadas pelo HIV é comparada entre as células que expressam SAMHD1 e aquelas que não possuem SAMHD1 dentro do mesmo poço de células. Isso proporciona um controle interno no tubo de citometria de poço/fluxo, que é uma característica fundamental. A comparação dos níveis de infecção em células transduzidas e não transduzidas revela uma razão de restrição. Uma razão de 1,0 indica que o fator transduzido não tem efeito sobre a infectividade. A expressão de SAMHD1 do tipo selvagem leva a uma redução de cinco vezes na infecção pelo HIV neste ensaio, correspondendo a uma razão de restrição de 0,2. Embora esse efeito seja modesto em comparação com fatores de restrição mais clássicos, como o TRIM5, o efeito é, no entanto, reprodutível e permite a classificação de expressores SAMHD1 modificados naqueles que se restringem de maneira equivalente à proteína do tipo selvagem, aqueles que não conseguem restringir e aqueles com um fenótipo intermediário.
Este ensaio tem sido usado com sucesso para caracterizar os fenótipos de restrição do domínio SAMHD1 e dos mutantes de aminoácidos, transduzindo com vírus codificando sequências SAMHD1 mutantes. Por exemplo, as substituições de local catalítico HD206-7AA não conseguem restringir neste ensaio. Da mesma forma, a suscetibilidade de diferentes vírus testadores pode ser determinada. Por exemplo, os mutantes da transcriptase reversa do HIV-1 são mais suscetíveis à restrição mediada pela SAMHD1 (por exemplo, 151V4). Este protocolo descreve os detalhes da produção de partículas semelhantes a vírus (VLP), transdução de U937 com vetores de expressão SAMHD1, infecção por HIV portando um repórter fluorescente e a análise subsequente por citometria de fluxo. Este artigo discute quais dados esperar e como evitar resultados abaixo do ideal. Finalmente, usos alternativos para o ensaio são delineados, além de examinar diferentes variantes de SAMHD1 para entender a interação entre SAMHD1, níveis de dNTP e infecção viral mais profundamente. Dado o papel do SAMHD1 no centro do metabolismo celular, com ligações adicionais ao câncer, esta continua a ser uma área de intenso interesse.
Como discutido nas notas acima, os aspectos críticos do protocolo giram em torno da retenção do fenótipo celular correto para a produção de VLP e para a criação do ambiente apropriado para observar a restrição SAMHD1. Em primeiro lugar, a análise precisa da restrição por citometria de fluxo de duas cores depende de alcançar proporções apropriadas de células transduzidas e infectadas para que haja células suficientes em cada área do gráfico para análise. Como tal, o investigador deve visar um MOI inferior a 1 (ver Protocolo). As taxas de transdução e infecção que são muito altas ou muito baixas levam a problemas com a análise devido à falta de células não infectadas ou duplamente infectadas. Da mesma forma, uma taxa de transdução semelhante para vetores SAMHD1 a serem comparados é fundamental para permitir que a mesma matriz de compensação e gating sejam aplicados a todo o experimento, aumentando a confiança na análise subsequente.
Em segundo lugar, a idade das células U937 usadas é um fator-chave para saber se elas se diferenciam com sucesso. A diferenciação bem-sucedida pode ser monitorada através da observação da adesão, uma acidificação reduzida do meio ao longo do tempo após a diferenciação e restrição adequada pelo tipo selvagem de controle positivo no ensaio. A diferenciação de até 5 dias foi bem sucedida.
Uma das principais vantagens deste ensaio é a sua flexibilidade. Uma variedade de versões modificadas do SAMHD1 (domínios, aminoácidos, sequências de espécies) pode ser testada através de mutagênese simples dirigida ao local do vetor ou clonagem. Da mesma forma, variantes do vírus testador podem ser exploradas. O ensaio foi usado anteriormente para demonstrar que os mutantes da transcriptase reversa do HIV-1 com capacidade reduzida de se ligar ao dNTP são mais sensíveis à restrição da SAMHD1. O mesmo princípio pode ser usado para testar a restrição de outros vírus pelo SAMHD1. Além disso, condições de diferenciação variadas ou manipulação artificial das concentrações intracelulares de dNTP podem ser usadas para investigar ainda mais a interação entre as condições intracelulares e a atividade da SAMHD1, uma área de pesquisa ativa no laboratório Bishop. A interação da SAMHD1 com vários inibidores da transcriptase reversa de nucleosídeos também foi descrita, e o efeito da SAMHD1 demonstrado usando este ensaio modificado para uso em células primárias12,13,14,15.
A adaptação do protocolo para uso em células primárias supera a limitação colocada pelo exame de fenótipos metabólicos em células transformadas. No entanto, o formato existente permite um protocolo conveniente e menos tecnicamente desafiador para análise de alto rendimento, especialmente com o uso de um citômetro de fluxo com um amostrador de alto rendimento. Ao adaptar o protocolo, a suscetibilidade das células internamente não transduzidas a efeitos de espectador (por exemplo, sinalização imunológica) deve ser considerada.
Tal como acontece com muitos aspectos da biologia celular, é essencial que tais ensaios sejam usados como parte de uma abordagem holística para a compreensão de um determinado fenômeno. O uso paralelo de ensaios bioquímicos para a atividadeSAMHD1 16, a quantificação de pools intracelulares de dNTP e a observação de fenótipos mutantes SAMHD1 em humanos, ex vivo e em modelos animais (sendo realizados por laboratórios de todo o mundo, alguns descritos nesta edição) são fundamentais para a evolução da compreensão dessa proteína complexa.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado pelo Francis Crick Institute, que recebe seu financiamento principal da Cancer Research UK (FC001042 e FC001162), do Conselho de Pesquisa Médica do Reino Unido (FC001042 e FC001162) e do Wellcome Trust (FC001042 e FC001162) e por um Wellcome Trust Investigator Award para JPS (108012/Z/15/Z). O trabalho na Universidade de Cambridge foi co-financiado pelo NIHR Cambridge Biomedical Research Centre, The Evelyn Trust (16/21), The Rosetrees Trust (M590) e pelo Conselho de Pesquisa Médica do Reino Unido (MR / S009752/1). Este último prémio financiado pelo Reino Unido faz parte do programa EDCTP-2 apoiado pela União Europeia.
293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
0.45 µm syringe filters | Sartorius | FCT122 | |
10 cm dishes | Corning | 430167 | virus preps can be scaled up through transfection in higher capacity plates/flasks – see transfection reagent guidance |
12 well plates | Greiner | 665180 | |
24 well plates | Greiner | 662160 | |
BD LSRFortessa cell analyzer | BD Bioscience | 649225 | alternative analysers can be used as long as they can read RFP and YFP fluorescence |
DMEM | Sigma | D6429 | ATCC recommends Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) is modified to contain 4 mM L-glutamine, 4500 mg/L glucose, 1 mM sodium pyruvate, and 1500 mg/L sodium bicarbonate. |
DMSO | Fisher | BP-231-100 | |
fetal bovine serum | Gibco | 10500064 | |
Flowjo | BD Bioscience | – | alternative analysis software can be used |
light microscope | – | – | Any bright field light microscope |
p8.91 | – | – | HIV GagPol expressor (PMID: 8602510) |
paraformaldehyde (4 % in PBS) | Alfa Aesar | J61889 | |
PBS | Sigma | D8537 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140122 | |
phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma | P8139 | |
polybrene | Sigma | TR-1003 | |
pKB4 | – | – | Murine leukaemia Virus GagPol expressor (PMID: 23035841) |
pLGatewaySAMHD1eYFP | – | – | MLV packaging plasmid encoding wild-type human sequence. Details and cloning procedures Arnold et al 2015 (Ref 1). |
pLGatewaySAMHD1HD206-7AAeY FP |
– | – | As above, encodes amino acid substitutions at crucial active sites residues |
Prism | Graphpad | – | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ Other data representation software are also suitable |
pVSV-G | – | – | VSV-G expressor (https://www.addgene.org/138479/), alternative: pMD2.G (https://www.addgene.org/12259/) |
RPMI | ThermoFisher | 21875034 | |
screw-cap tubes | StarLab | E1415-2231 | |
SCRPSY | – | – | HIV packaging plasmid encoding RFP, Sam Wilson, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5026698/ |
stripettes 10 mL | Corning | 10084450 | |
stripettes 5 mL | Corning | 10420201 | |
TrypLE express | Gibco | 12604021 | Trypsin will also be suitable |
Turbofect | ThermoFisher | R0531 | alternative transfection reagents will also work well |
U937 cells | ATCC | CRL-1593.2 |