선명도 조직 클리어링을 통한 손상되지 않은 뉴런 덴라이트의 이미징 및 정량화
Summary
신경 수지상 형태는 종종 기능의 근간을 이수합니다. 실제로, 뉴런의 발달에 영향을 미치는 많은 질병 프로세스는 형태학적 표현형으로 나타납니다. 이 프로토콜은 그대로 수지상 식소및 연관된 척추를 분석하는 간단하고 강력한 방법을 설명합니다.
Abstract
뇌 활동, 신경 사이 전달 된 전기 화학 신호, 신경 네트워크의 연결 패턴에 의해 결정, 그리고 이러한 뉴런 내에서 프로세스 및 하위 구조의 형태에서. 따라서 뇌 기능에 대해 알려진 많은 것들이 뇌에서 뉴런이 조직되고 연결되는 방법에 대한 추가 통찰력을 허용하는 이미징 기술의 발전과 함께 발생했습니다. 조직 정리의 개선은 두꺼운 뇌 조각의 고해상도 이미징을 허용, 형태 학적 재건을 용이하게하고 신경 하위 구조의 분석, 수지상 식소 및 척추와 같은. 이미지 처리 소프트웨어의 발전은 대규모 이미징 데이터 집합을 신속하게 분석하는 방법을 제공합니다. 이 작품은 CLARITY 조직 클리어링, 공초점 현미경 검사및 이미지 분석을 사용하여 고해상도로 표지된 신경 조직의 두꺼운 조각을 처리, 시각화 및 분석하는 비교적 빠른 방법을 제시합니다. 이 프로토콜은 건강한 두뇌를 특징짓는 연결 패턴 및 신경 형태학및 병들인 두뇌 상태에서 생기는 이 특성에 있는 변경을 이해하기 위한 노력을 촉진할 것입니다.
Introduction
복잡한 3차원 생물학적 구조의 공간 조직, 연결 패턴 및 형태에 대해 이해하는 것은 특정 세포 및 조직의 기능을 파기하는 데 필수적입니다. 이것은 신경 과학에서 특히 사실이다, 있는 엄청난 노력은 중추 신경계의 고해상도 신경 해부학지도를 구축하는 데 전념하고있다1,2. 이러한 지도를 구성하는 뉴런의 면밀한 검사는 다양한 형태학을 산출하며, 이러한 다양한 뉴런 세트의 기능을 반영하는 연결 및위치3,4. 더욱이, 세포외 구조, 특히 수지상 척추에 대한 조사는 시냅스의 성숙도를 알릴 수 있어 발달 과정 및 신경질환 상태를 반영하여5,6,7. 따라서 이미징 해상도와 처리량을 개선하는 접근 방식은 모든 척도에서 뇌 기능을 더 잘 이해하는 데 필수적입니다.
최근 발전은 뉴런의 인구를 표시하고 조작하기위한 분자 및 유전 도구 키트를 확장했다. 뉴런에 이러한 마커를 도입하는 새로운 방법과 결합 된 새로운 형광 마커의 개발은 동일한 동물 또는 뇌 샘플8,9,10,11내에서 상호 작용하는 뉴런의 인구의 차동 라벨링을 허용합니다. 빛은 불투명한 지질에 의해 흩어져 있고, 뇌 조직의 높은 지질 함량을 감안할 때, 이미징 신경 인구는 주로 얇은 섹션으로 제한되었거나 고급 현미경 기술 (예를 들어, 공초점, 다광자 및 광시트 현미경 검사법)에 의존하여 깊은 구조를 이미지화합니다. 그러나, 이러한 노력은 크게 조직 정리 기술에 어드밴스에 의해 강화 되었습니다. 클리어 지질 교환 아크릴아미드-혼성 경질 영상/면역스테인링/시투 혼성화 호환 티슈-하이드로겔(CLARITY)은 하이드로겔 모노머(아크릴아미드와 비스 아크릴아미드)를 주입한 후 세제12로세척하는 기술 중 하나입니다. 하이드로겔 모노머는 매시분자 라벨에 광학적으로 투명하고 투과성이 있는 안정적인 3D 하이드로겔 스캐폴드를 만들기 위해 혼성화한다. 핵산과 단백질은 혼성화된 매트릭스 내에서 유지되는 반면, 지질은 세제 세시에 의해 제거된다(도1). 이것은 세포와 비 지질 분자의 원래 모양과 방향을 유지하기에 충분히 단단한 안정된 조직을 초래하고, 광학적으로 고해상도로 깊은 구조를 쉽게 이미지할 수 있을 만큼 충분히 투명합니다. 조직 구조와 방향의 이러한 유지 보수는 두꺼운 슬라이스의 이미징을 허용하여 세포 대 세포 연결 및 공간 관계를 보존합니다. 더욱이, 단백질과 핵산의 위치 및 가용성이 청산 과정에서 유지되기 때문에, 클리어 조직은 발현 기반 마커뿐만 아니라 외인성 라벨을 보유할 수 있다. 따라서 CLARITY는 많은 양의 심층 뇌 구조와 고해상도에서 이러한 구조 사이의 연결을 이미징하는 강력한 방법으로 자신을 빌려줍니다.
CLARITY의 사용은 크게 이미징 신경 인구에 대한 접근을 향상시킵니다. 이 기술은 많은 양의 이미징 데이터를 생성하는 데 특히 능숙합니다. CLARITY는 여러 형태의 단백질 기반 형광과 잘 어립니다. 이 프로토콜은 EGFP 및 tdTomato를 사용하여 세포에 드물게 라벨을 붙이기 위해 렌즈피바이러스 기반 접근법을 활용합니다. 그러나, tdTomato 또는 EGFP를 표현하는 형질 전환 기자 는 정기적으로 사용되었습니다. 사진 안정적이고 밝은 형광소를 선택하는 것이 중요합니다 (예 : EGFP 또는 tdTomato). 또한, 강력한 프로모터를 사용하여 플루오로포어를 표현하면 뛰어난 콘트라스트와 이미지 품질을 얻을 수 있습니다. 이 기술의 단점은 이 많은 양의 데이터를 적절히 분석하는 것으로 발생하며, 이는 인건비와 시간 집약적일 수 있습니다. 특수 현미경은 처리량을 개선하고 작업 부하를 줄이는 데 도움이 될 수 있습니다. 그러나, 건물, 소유 및/또는 고급 현미경을 운영하는 것은 종종 많은 실험실에 대한 비용 금지입니다. 이 작품은 표준 공초점 현미경 검사법과 결합된 큰 단면의 CLARITY 조직 클리어링을 사용하여 고해상도로 많은 양의 신경 조직을 시각화하는 높은 처리량, 상대적으로 빠르고 간단한 방법을 제시합니다. 본 프로토콜은 다음 단계를 통해 이러한 접근법을 설명한다: 1) 해부 및 신경 조직 준비, 2) 조직을 청산, 3) 조직을 장착, 4) 준비된 조각을 이미징, 및 5) 현미경 시각화 소프트웨어 재구성 및 분석을 사용하여 전체 슬라이스 이미지를처리(그림 2). 이러한 노력은 뉴런의 인구, 신경 연결 패턴, 3D 수지상 형태, 수지상 척추 풍부 및 형태학, 그리고 그대로 뇌 조직 내에서 분자 발현 패턴을 분석하는 데 사용할 수있는 고해상도 이미지를 초래합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
현대 조직 청산 기술의 출현 전에, 신경 형태를 공부하는 것은 시간 집약적인 단면, 화상 진찰 및 인접한 아주 얇은 단면도의 재건으로 이루어져 있습니다. 공초점 화상 진찰과 함께 전기 전구 클리어링을 사용하면 완전한 신경 형태에 대한 방해받지 않는 시각을 제공합니다. 그대로 수지상 나무에서 가장 작은 시냅스 부톤까지, 신경 형태에 이미징과 정량화하는 것은 그 어느 때보다 도드라졌습?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 이러한 실험에 사용되는 AAV 및 렌즈 바이러스를 생산하기위한 1 월과 댄 던컨 신경 학 연구소의 바이러스 코어 NRDDC에 감사드립니다. 또한, 우리는 마우스 축산 및 사용되는 마우스의 일반적인 유지 보수에 대한 비교 의학에 대한 베일러 대학 의학 센터에 감사드립니다. 20PRE35040011, 황동: 베일러 연구 옹호자들의 지원에 감사드립니다(PJH). 마지막으로, 로고X-선명도 전기전도 조직 정리 시스템을 실험실에 제공한 로고스에게 감사드립니다.
Materials
| 15 mL Conical Tube | Thermo Scientific | 339650 | |
| 25 G x 1" Needle | BD | 305127 | |
| 30% Acrylamide (No-Bis) | National Diagnostics | EC-810 | |
| 50 mL Conical Tube | Thermo Scientific | 339653 | |
| Electrophoretic Tissue Clearing Solution | Logos | C13001 | |
| Histodenz | Sigma | D2158-100G | |
| Hydrogel Solution Kit | Logos | C1310X | |
| Imaris | Oxford Instruments | N/A | |
| Paraformaldehyde 16% | EMS | 15710 | |
| PBS, 1x, 500 mL, 6 bottles/case | fisher | MT21040CV | |
| VA-044 | Wako | 925-41020 | |
| X-CLARITY Polymerization System | Logos | C20001 | |
| X-CLARITY Tissue Clearing System II | Logos | C30001 |
References
- Abbott, L. F., et al. The Mind of a mouse. Cell. 182 (6), 1372-1376 (2020).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 314 (1165), 1 (1986).
- Jiang, X., et al. Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex. Science. 350 (6264), (2015).
- Winnubst, J., et al. Reconstruction of 1,000 projection neurons reveals new cell types and organization of long-range connectivity in the mouse brain. Cell. 179 (1), 268-281 (2019).
- Araya, R., Vogels, T. P., Yuste, R. Activity-dependent dendritic spine neck changes are correlated with synaptic strength. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (28), (2014).
- Bosch, M., Hayashi, Y. Structural plasticity of dendritic spines. Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 383-388 (2012).
- Martínez-Cerdeño, V. Dendrite and spine modifications in autism and related neurodevelopmental disorders in patients and animal models. Developmental Neurobiology. 77 (4), 393-404 (2017).
- Arenkiel, B. R., Ehlers, M. D. Molecular genetics and imaging technologies for circuit-based neuroanatomy. Nature. 461 (7266), 900-907 (2009).
- Kim, E. H., Chin, G., Rong, G., Poskanzer, K. E., Clark, H. A. Optical probes for neurobiological sensing and imaging. Accounts of Chemical Research. 51 (5), 1023-1032 (2018).
- Weissman, T. A., Pan, Y. A. Brainbow: New resources and emerging biological applications for multicolor genetic labeling and analysis. Génétique. 199 (2), 293-306 (2014).
- Haggerty, D. L., Grecco, G. G., Reeves, K. C., Atwood, B. Adeno-associated viral vectors in neuroscience research. Molecular Therapy – Methods and Clinical Development. 17, 69-82 (2020).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Kanning, K. C., Kaplan, A., Henderson, C. E. Motor neuron diversity in development and disease. Annual Review of Neuroscience. 33, 409-440 (2010).
- Ledda, F., Paratcha, G. Mechanisms regulating dendritic arbor patterning. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (24), 4511-4537 (2017).
- Falougy, H. E., Filova, B., Ostatnikova, D., Bacova, Z., Bakos, J. Neuronal morphology alterations in autism and possible role of oxytocin. Endocrine Regulations. 53 (1), 46-54 (2019).
