RIBO-seq in Bacteria: коллекция образцов и протокол подготовки библиотеки для секвенирования NGS

Summary

Здесь мы опишем этапы отбора проб и подготовки к RIBO-seq у бактерий. Секвенирование библиотек, подготовленных в соответствии с этими руководящими принципами, приводит к получению достаточных данных для всестороннего биоинформатического анализа. Протокол, который мы представляем, прост, использует стандартное лабораторное оборудование и занимает семь дней от лизиса до получения библиотек.

Abstract

Метод профилирования рибосом (RIBO-seq) в настоящее время является наиболее эффективным инструментом для изучения процесса синтеза белка in vivo. Преимуществом этого метода, по сравнению с другими подходами, является его способность контролировать трансляцию путем точного отображения положения и количества рибосом на транскрипте мРНК.

В этой статье мы опишем последовательные этапы сбора проб и подготовки к методу RIBO-seq у бактерий, выделив детали, имеющие отношение к планированию и выполнению эксперимента.

Поскольку RIBO-seq опирается на интактные рибосомы и связанные с ними мРНК, ключевым шагом является быстрое ингибирование трансляции и адекватный распад клеток. Таким образом, мы предлагаем фильтрацию и мгновенное замораживание жидкого азота для сбора клеток с дополнительной предварительной обработкой хлорамфениколом для остановки трансляции бактерий. Для распада мы предлагаем шлифовать замороженные клетки раствором и пестиком в присутствии оксида алюминия, чтобы механически разрушить клеточную стенку. В этом протоколе не требуется сахарозная подушка или ультрацентрифугирование градиента сахарозы для очистки моносом. Вместо этого проводится разделение мРНК с использованием электрофореза полиакриламидного геля (PAGE) с последующим иссечением рибосомного следа (полоса 28-30 нт) и дает удовлетворительные результаты. Это значительно упрощает метод, а также сокращает время и требования к оборудованию для процедуры. Для подготовки библиотеки мы рекомендуем использовать коммерчески доступный небольшой набор РНК для секвенирования Illumina от New England Biolabs, следуя рекомендациям производителя с некоторой степенью оптимизации.

Полученные библиотеки кДНК представляют соответствующее количество и качество, необходимые для секвенирования следующего поколения (NGS). Секвенирование библиотек, подготовленных в соответствии с описанным протоколом, приводит к 2-10 млн однозначно нанесенных на карту считывания на образец, что обеспечивает достаточные данные для всестороннего биоинформатического анализа. Протокол, который мы представляем, является быстрым и относительно простым и может быть выполнен с помощью стандартного лабораторного оборудования.

Introduction

Методика профилирования рибосом (RIBO-seq) была разработана в лаборатории Джонатана Вайсмана в Калифорнийском университете в Сан-Франциско^1. По сравнению с другими методами, используемыми для изучения экспрессии генов на трансляционном уровне, RIBO-seq фокусируется на связывании каждой рибосомы с мРНК и предоставляет информацию о ее местоположении и относительном количестве рибосом на транскрипте. Он позволяет контролировать процесс синтеза белка in vivo и может обеспечить одно разрешение и точность кодона, что позволяет измерять плотность рибосом как на отдельной мРНК, так и на всем транскриптоме в клетке. В основе методики RIBO-seq лежит тот факт, что во время трансляции рибосома связывает молекулу мРНК и тем самым защищает погребенный фрагмент транскрипта от переваривания рибонуклеазы. При добавлении рибонуклеазы незащищенная мРНК переваривается, и фрагменты, заключенные рибосомами – обычно длиной ~ 28-30 нт – остаются нетронутыми. Эти фрагменты, называемые рибосомными следами (RF), затем могут быть выделены, секвенированы и нанесены на транскрипт, из которого они произошли, что приводит к обнаружению точного положения рибосом. Фактически, способность рибосомы защищать фрагменты мРНК используется с 1960-х годов для изучения рибосомных сайтов связывания и инициации трансляции (TIS)^2,3,4. Однако с развитием технологии глубокого секвенирования RIBO-seq стал золотым стандартом для мониторинга трансляции^5, который благодаря взаимодействию с рибосомами может предоставить общегеномную информацию о синтезе белка^6. Профилирование рибосом заполнило технологический пробел, который существовал между количественной оценкой транскриптома и протеома^6.

Для проведения рибосомного профилирования необходимо получить лизат клеток организма, выросших в исследуемых условиях. Нарушение этих условий во время сбора и лизиса клеток может обеспечить ненадежные данные. Чтобы предотвратить это, обычно используются ингибиторы трансляции, быстрый сбор и мгновенное замораживание в жидком азоте. Клетки могут быть лизированы криогенным измельчением в механическом гомогенизаторе, таком как смеситель мельницы^7,8 или бисерный взбиватель^9,и путем тритурации через пипетку¹⁰ или с помощью иглы^11. Буфер лизиса может быть добавлен непосредственно перед или вскоре после измельчения клеток. В нашем протоколе мы используем жидкий азот для предварительного охлаждения раствора и пестиков, а также оксид алюминия в качестве более мягкого подхода к разрушению бактериальной клеточной стенки, что предотвращает сдвиг РНК, часто встречающийся при применении таких методов, как сонификация. После измельчения мы добавляем ледяной буфер лизиса в охлажденный содержимое раствора. Выбор подходящего буфера лизиса важен для получения наилучшего разрешения рибосомных следов. Поскольку ионная сила влияет как на размер ВЧ, так и на точность кадра считывания, в настоящее время рекомендуется использовать лизисные буферы с низкой ионной силой и буферной емкостью, даже если окажется, что буферный состав не влияет на рибосомную занятость на мРНК^11,12. Важными компонентами лизисного буфера являются ионы магния, наличие которых предотвращает диссоциацию рибосомных субъединиц и подавляет спонтанные конформационные изменения в бактериальных рибосомах^11,13. Ионы кальция также играют значительную роль и необходимы для активности микрококковой нуклеазы (МНазы), используемой в методе профилирования бактериальных рибосом^14. Добавление гуанозина 5′-[β,γ-имидо]трифосфата (GMP-PNP), негидролизуемого аналога ГТФ, вместе с хлорамфениколом ингибирует трансляцию во время лизиса^15.

При получении лизата его осветляют центрифугированием и делят на две части, каждая для RIBO-seq и высокопроизводительного полного секвенирования мРНК (RNA-seq), поскольку они выполняются одновременно(фиг.1). RNA-seq обеспечивает точку отсчета, которая позволяет сравнивать данные как RIBO-seq, так и RNA-seq во время анализа данных. Исследуемый транслейлом определяется нормализацией рибосомных следов до обилия мРНК^16. Данные из RNA-seq также могут помочь идентифицировать артефакты клонирования или секвенирования¹⁷.

Рисунок 1. Схемы пробоподготовки мРНК для RIBO-seq и RNA-seq. Для подготовки библиотеки RIBO-seq РНК переваривается МНазой (A), с последующим выбором размера РЧ ~28-30 nt длины (B); для РНК-seq РНК выделяют (С), истощают рРНК (D), а полученную мРНК случайным образом фрагментируют на фрагменты различной длины (Е). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Начальные этапы процедуры пробоподготовки для RIBO-seq и RNA-seq отличаются незначительно(рисунок 1). Для рибосомного профилирования лизат должен быть переварен специфической эндонуклеазой, чтобы раздуть молекулы мРНК, не защищенные рибосомами. В стандартных протоколах полученные моносомы восстанавливают ультрацентрифугированием сахарозной подушки или ультрацентрифугированием градиента сахарозы^8,14. В этой статье мы показываем, что этот шаг не является необходимым для выделения РЧ, необходимого для RIBO-seq у бактерий, аналогично для эукариотических клеток^18,и что выбор размера фрагментов мРНК соответствующей длины из полиакриламидного геля является достаточным.

Для РНК-seq мРНК получается путем истощения рРНК из общей РНК – молекулы рРНК гибридизируются с биотинилированными олигонуклеотидными зондами, которые связываются с магнитными шариками, покрытыми стрептавидином. Комплексы рРНК-олигонуклеотид-шарики затем удаляются из образца магнитом, в результате чего рРНК истощается образцом^19,20. Очищенные молекулы мРНК затем случайным образом фрагментируются щелочным гидролизом. Полученные фрагменты мРНК, а также рибосомные следы преобразуются в библиотеки кДНК и подготавливаются к глубокому секвенированию(рисунок 2). Это включает в себя восстановление концов, необходимое после щелочного гидролиза (для мРНК) и ферментативного пищеварения (для RF): дефосфорилирование 3′ концов с последующим фосфорилированием 5′ концов. Следующими шагами являются лигирование адаптеров и обратная транскрипция для создания вставок кДНК, обрамленных последовательностями, необходимыми для секвенирования следующего поколения (NGS) с использованием платформы Illumina. Последняя фаза подготовки библиотеки представляет собой реакцию ПЦР, в которой конструкции усиливаются и маркируются штрих-кодами для конкретных образцов, чтобы обеспечить мультиплексирование и секвенирование различных образцов на одном канале. Перед секвенированием качество и количество библиотек оцениваются с помощью высокочувствительного электрофореза ДНК на кристалле. Затем библиотеки cDNA с соответствующими параметрами могут быть объединены в пул и секвенированы. Секвенирование может выполняться на различных платформах Illumina, таких как MiSeq, NextSeq или HighSeq, в зависимости от количества библиотек, требуемой длины чтения и глубины секвенирования. После секвенирования проводится биоинформатический анализ.

Рисунок 2. Подготовка библиотеки. Подготовка библиотеки включает в себя ремонт концов, перевязку адаптеров, обратную транскрипцию и усиление штрих-кодированием. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Профилирование рибосом является универсальным методом, который может быть легко модифицирован и скорректирован в соответствии с научным вопросом. Первоначально он использовался в дрожжах^1,но вскоре после этого он был применен к бактериальным клеткам^21, а также к эукариотическим модельным организмам, включая мышь^10,рыбку данио^22,плодовую^{муху 23} и Arabidopsis thaliana^24. Он также использовался для изучения различных типов рибосом: цитоплазматических, митохондриальных^25,26 и хлоропластов^27,28. У эукариот RIBO-seq обычно адаптируется и уточняется для исследования конкретных аспектов трансляции, включая инициацию^{10,11,29,30,31,32,}удлинение^{1,10,11,31,33,}рибосомное сваливание³³ и изменение конформации^33. Большинство модификаций предполагают использование различных ингибиторов трансляции. Однако на бактериях аналогичные исследования было трудно провести из-за нехватки ингибиторов с требуемым механизмом действия^34. Наиболее часто используемым ингибитором трансляции у бактерий является хлорамфеникол (CAM), который связывается с центром пептидилтрансферазы (PTC) и предотвращает правильное позиционирование аминоацил-тРНК в А-сайте. В результате CAM предотвращает образование пептидной связи, что приводит к остановке удлиняющихся рибосом^35. Другими примерами ингибиторов трансляции у бактерий являются тетрациклин (TET)^36,ретапамулин (RET)³⁴ и Onc112^37, которые использовались для исследования сайтов инициации трансляции. ТЕТ, который предотвращает доставку тРНК в рибосому путем прямого перекрытия с антикодоном стволовым контуром тРНК в А-месте, первоначально применялся для проверки результатов, полученных от лечения CAM, поскольку они оба являются антибиотиками, ингибируя удлинение трансляции^38. Было обнаружено, что TET обнаруживает первичный TIS, однако не смог выявить внутренний TIS^36. RET связывается в PTC бактериальной рибосомы и предотвращает образование первой пептидной связи путем вмешательства в элонгатор аминоацил-тРНК в месте А. Применение RET приводит к остановке рибосом как на первичном, так и на внутреннем TISs^34. Onc112, богатый пролином антимикробный пептид, связывается в выходном туннеле и блокирует связывание аминоацил-тРНК в рибосомном участке А. В результате Onc112 предотвращает вход комплексов инициации в фазу^{удлинения 37.}

Основной информацией, которую обеспечивает профилирование рибосом, является плотность рибосом и их положение на мРНК. Он был успешно применен для исследования дифференциальной экспрессии генов на уровне трансляции в различных условиях роста^1,6,измерения поступающей эффективности^1,38,39 и обнаружения событий регуляции трансляции, таких как рибосомная пауза^10. RIBO-seq также позволяет раскрыть трансляцию аннотированных ncRNA, псевдогенов и неаннотированных малых открытых кадров чтения (ORF), что приводит к идентификации новых и/или очень коротких генов, кодирующих белки^{10,12,22,30,37.} В таких случаях RIBO-seq может точно настроить и улучшить аннотацию генома. Обладая высокой чувствительностью к идентификации переведенных ОРФ и его количественной природой, профилирование рибосом может также служить прокси для определения протеома или в оказании помощи протеомным исследованиям^31,34,39. Путем картирования TIS, профилирование рибосом выявляет N-терминально расширенные и усеченные изоформы известных белков^10,32. RIBO-seq также был адаптирован для изучения ко-трансляционного сворачивания белков^14,21,24. Этот метод позволяет измерять скорости удлинения^1,10,39 или скорость декодирования отдельных кодонов⁶ и помогает в разработке количественных моделей трансляции^17. Метод профилирования рибосом также способен обеспечить механистическое понимание паузы рибосомы у бактерий^7,15,17,сдвига кадра^40,стоп-кодона через^21,дефектов терминации/рециркуляции^41,42 и рибосомных конформационных изменений³³ у эукариот. RIBO-seq также был адаптирован для изучения влияния специфических трансдействующих факторов на трансляцию, таких как миРНК⁶ и РНК-связывающие белки у эукариот^16,43. Однако важно признать, что экспериментальная конструкция и полученная разрешение RIBO-seq определяют объем информации, которая может быть извлечена из полученных данных секвенирования^12.

Protocol

1. Сбор образцов Подготовьте бактериальную культуру. Мы рекомендуем культуру объемом 100 мл на образец. Подготовка оборудования и реагентов для отбора проб: две мерные ложки на образец, стерильные мембранные фильтры смешанных эфиров целлюлозы (MCE) 0,45 мкм, стерильные пробирки об…

Representative Results

Примерные результаты, представленные здесь, были получены в исследовании, изучающего регуляцию трансляции в спорулирующих клетках WT Bacillus subtilis. Ночные культуры разбавляли до OD600, равного 0,1 в 100 мл богатой среды, и инкубировали при 37 °C с энергичным встряхиванием до тех пор, пок?…

Discussion

Ключевой технической проблемой профилирования рибосом является необходимость быстрого ингибирования трансляции, чтобы захватить снимок рибосом на мРНК в определенном физиологическом состоянии, представляющих интерес. Для этого обычно используются ингибиторы трансляции, быстрый с?…

Materials

10X TBE (powder)	Invitrogen	AM9864
2-Mercaptoethanol, 99%, pure	Acros Organics	125472500
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP)	New England Biolabs	P0756S
Aluminium oxide calcinated pure p.a.	Chempur	114560600
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C3881-500G
Chloramphenicol	MP Biomedicals	190321
DNA Clean & Concentrator -5	Zymo Research	D4004
Dnase I recombinant, Rnase-free	Roche	4716728001
EDTA disodium salt	Fisher Scientific	E/P140/48
Ethyl Alcohol Absolut 99,8%  Pure-P.A.-Basic	POCH Avantor Performance Materials Poland S.A	BA6480111
Filtration apparatus	VWR Collection	511-0265	all-glass filtration apparatus, with funnel, fritted base, cap, 47 mm Ø spring clamp and ground joint flask
Gel 40 (19:1)	Rotiphorese	3030.1
Gel Loading Dye, Blue, 6X	New England Biolabs	E6138G
Guanosine 5′-[β,γ-imido]triphosphate trisodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	G0635-25MG
labZAP	A&A Biotechnology	040-500
Magnesium acetate tetrahydrate	Sigma-Aldrich	M5661-250G
MCE membrane fiter	Alfatec Technology	M47MCE45GWS	pore size: 0.45um
MICROBExpress Bacterial mRNA Purification	Invitrogen	AM1905
Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina	New England Biolabs	E7300S
Nuclease-Free Water	Ambion	AM9937
Potassium Acetate Anhydrous Pure P.A.	POCH Avantor Performance Materials Poland S.A	744330113
Quick-Load pBR322 DNA-MspI Digest	New England Biolabs	E7323A
RNA Clean & Concentrator -25	Zymo Research	R1018
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	S2889-250G
Sodium carbonate	Sigma-Aldrich	223530-500G
Sodium hydrogen carbonate pure p.a.	POCH Avantor Performance Materials Poland S.A	810530115
SYBR Gold nucleic acid gel stain	Life Technologies	S11494
T4 Polynucleotide Kinase	New England Biolabs	M0201L
T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer	New England Biolabs	B0201S
TBE-Urea Sample Buffer (2x)	Invitrogen	LC6876
Tris(hydroxymethyl)amino-methane, ultrapure, 99,9%	AlfaAesar	J65594
Triton X-100, 98%	Acros Organics	327371000
Urea G.R.	lach:ner	40096-AP0