अनुमस्तिष्क ग्रेन्युल न्यूरॉन आकृति विज्ञान और सिनैप्स विकास का अध्ययन करने के लिए विवो प्रसवोत्तर इलेक्ट्रोपोरेशन में उपयोग करना
Summary
यहां हम प्रसवोत्तर मस्तिष्क के विकास के समय में माउस सेरिबैलम में ग्रेन्युल न्यूरॉन्स के सिनैप्टोजेनेसिस की कल्पना करने के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं जब ये कोशिकाएं अपनी सिनैप्टिक संरचनाओं को परिष्कृत करती हैं और समग्र मस्तिष्क सर्किट में खुद को एकीकृत करने के लिए सिनैप्स बनाती हैं।
Abstract
न्यूरॉन्स अन्य कोशिकाओं के साथ उचित संबंध बनाने के लिए मस्तिष्क के विकास के दौरान अपनी संरचना और कार्य में गतिशील परिवर्तन से गुजरते हैं। कृंतक सेरिबैलम एक एकल कोशिका प्रकार, अनुमस्तिष्क ग्रेन्युल न्यूरॉन (सीजीएन) के विकास और मोर्फोजेनेसिस को ट्रैक करने के लिए एक आदर्श प्रणाली है। यहां, विकासशील माउस सेरिबैलम में ग्रेन्युल न्यूरॉन पूर्वजों के विवो इलेक्ट्रोपोरेशन में बाद के रूपात्मक विश्लेषणों के लिए कोशिकाओं को विरल रूप से लेबल करने के लिए नियोजित किया गया था। इस तकनीक की प्रभावकारिता को सीजीएन परिपक्वता के प्रमुख विकास चरणों को प्रदर्शित करने की क्षमता में प्रदर्शित किया गया है, जिसमें डेंड्राइटिक पंजे के गठन पर एक विशिष्ट ध्यान दिया गया है, जो विशेष संरचनाएं हैं जहां ये कोशिकाएं अपने सिनैप्टिक इनपुट का बहुमत प्राप्त करती हैं। अनुमस्तिष्क विकास के दौरान सीजीएन सिनैप्टिक संरचनाओं के स्नैपशॉट प्रदान करने के अलावा, इस तकनीक को आनुवंशिक रूप से सेल-स्वायत्त तरीके से ग्रेन्युल न्यूरॉन्स में हेरफेर करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ताकि रुचि के किसी भी जीन की भूमिका और सीजीएन आकृति विज्ञान, पंजे के विकास और सिनैप्टोजेनेसिस पर इसके प्रभाव का अध्ययन किया जा सके।
Introduction
मस्तिष्क का विकास एक लंबी प्रक्रिया है जो भ्रूणजनन से प्रसवोत्तर जीवन तक फैली हुई है। इस समय के दौरान, मस्तिष्क आंतरिक और बाह्य उत्तेजनाओं के संयोजन को एकीकृत करता है जो अंततः व्यवहार का मार्गदर्शन करने के लिए डेंड्राइट और अक्षतंतु के बीच सिनैप्स के तारों को गढ़ता है। कृंतक सेरिबैलम यह अध्ययन करने के लिए एक आदर्श मॉडल प्रणाली है कि सिनैप्स कैसे विकसित होते हैं क्योंकि एकल न्यूरॉन प्रकार, अनुमस्तिष्क ग्रेन्युल न्यूरॉन (सीजीएन) के विकास को ट्रैक किया जा सकता है क्योंकि यह पूर्वज कोशिका से परिपक्व न्यूरॉन में संक्रमण करता है। यह आंशिक रूप से, इस तथ्य के कारण है कि अनुमस्तिष्क प्रांतस्था का बहुमत प्रसवोत्तर रूप से विकसित होता है, जो जन्म के बाद आसान आनुवंशिक हेरफेर और सेल लेबलिंग की अनुमति देताहै।
स्तनधारियों में, सीजीएन भेदभाव भ्रूण के विकास के अंत में शुरू होता है जब हिंडब्रेन में प्रोलिफेरेटिव कोशिकाओं का एक उप-समूह सेरिबैलम 2,3,4 की सतह पर एक द्वितीयक जर्मिनल ज़ोन बनाने के लिए रोडम्बिक होंठ पर पलायन करता है। यद्यपि वे पूरी तरह से एक ग्रेन्युल न्यूरॉन पूर्वज (जीएनपी) पहचान के लिए प्रतिबद्ध हैं, ये कोशिकाएं प्रसवोत्तर दिन 14 (पी 14) तक बाहरी ग्रेन्युल परत (ईजीएल) के बाहरी हिस्से के भीतर प्रसार जारी रखती हैं। इस परत के प्रसार के परिणामस्वरूप सेरिबैलम का बड़े पैमाने पर विस्तार होता है क्योंकि ये कोशिकाएं विशेष रूप से सीजीएन5 को जन्म देती हैं। एक बार जब नवजात सीजीएन ईजीएल में कोशिका चक्र से बाहर निकल जाते हैं, तो वे आंतरिक ग्रेन्युल परत (आईजीएल) की ओर अंदर की ओर पलायन करते हैं, एक अक्षतंतु को पीछे छोड़ते हैं जो सेरिबैलम की आणविक परत में विभाजित और यात्रा करेगा, समानांतर फाइबर बनाता है जो पर्किंजे कोशिकाओं6 पर सिनैप्स करता है। आणविक परत के भीतर इन तंतुओं की स्थिति सेल-चक्र निकास के समय पर निर्भर है।
सीजीएन जो अंतर करते हैं, वे पहले आणविक परत के तल की ओर अपने समानांतर तंतुओं को छोड़ देते हैं, जबकि सीजीएन के अक्षतंतु जो बाद में अंतर करते हैं, वे शीर्ष 7,8 पर समूहित होते हैं। एक बार जब सीजीएन सेल बॉडी आईजीएल तक पहुंच जाती है, तो वे डेंड्राइट को विस्तृत करना शुरू कर देते हैं और पास के निरोधात्मक और उत्तेजक न्यूरॉन्स के साथ सिनैप्स बनाते हैं। सीजीएन का परिपक्व डेंड्राइटिक पेड़ चार मुख्य प्रक्रियाओं के साथ एक रूढ़िबद्ध वास्तुकला प्रदर्शित करता है। सीजीएन परिपक्वता के दौरान, इन डेंड्राइट के अंत में संरचनाएं एक पंजा बनाती हैं जो पोस्टसिनेप्टिक प्रोटीन 9,10 से समृद्ध हो जाती हैं। इन विशेष संरचनाओं, जिन्हें डेंड्राइटिक पंजे कहा जाता है, में ग्रेन्युल न्यूरॉन्स पर अधिकांश सिनैप्स होते हैं और पोन्स से उत्पन्न होने वाले काई फाइबर संक्रमणों से उत्तेजक इनपुट दोनों प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण होते हैं, साथ ही साथ स्थानीय गोल्गी कोशिकाओं से निरोधात्मक इनपुट भी होते हैं। एक बार पूरी तरह से कॉन्फ़िगर हो जाने के बाद, सीजीएन के सिनैप्टिक कनेक्शन इन कोशिकाओं को पूर्व-अनुमस्तिष्क नाभिक से पर्किन्जे कोशिकाओं तक इनपुट को रिले करने की अनुमति देते हैं, जो अनुमस्तिष्क प्रांतस्था से गहरे अनुमस्तिष्क नाभिक तक प्रोजेक्ट करते हैं।
विवो में जीएनपी का प्रसवोत्तर इलेक्ट्रोपोरेशन अन्य लेबलिंग-आधारित तरीकों पर फायदेमंद है, जैसे वायरल संक्रमण और ट्रांसजेनिक माउस लाइनों की पीढ़ी, क्योंकि वांछित संरचनाओं की अभिव्यक्ति को तेजी से समयरेखा पर प्राप्त किया जा सकता है, और विधि कोशिकाओं की एक छोटी आबादी को लक्षित करती है, जो सेल-स्वायत्त प्रभावों का अध्ययन करने में उपयोगी होती है। सीजीएन के रूपात्मक विकास का अध्ययन करने के लिए पूर्व अध्ययनों में इस पद्धति का उपयोग किया गया है; हालांकि, इन अध्ययनों ने या तो एक समय बिंदु या समय की एक छोटी खिड़की 9,10,11,12,13 पर ध्यान केंद्रित किया है। प्रसवोत्तर जीवन के पहले तीन हफ्तों में सीजीएन भेदभाव के पूरे समय पाठ्यक्रम में होने वाले सीजीएन आकृति विज्ञान में परिवर्तनों को दस्तावेज करने के लिए इस लेबलिंग विधि को छवि विश्लेषण के साथ जोड़ा गया था। ये डेटा सीजीएन डेंड्राइट विकास की गतिशीलता को प्रकट करते हैं जो अनुमस्तिष्क सर्किट के निर्माण को रेखांकित करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
अनुमस्तिष्क ग्रेन्युल न्यूरॉन्स स्तनधारी मस्तिष्क में सबसे प्रचुर मात्रा में न्यूरॉन्स हैं, जो कृंतक मस्तिष्क1,14 में कुल न्यूरॉन आबादी का लगभग 60-70% बनाते हैं। सेरिबैलम का बड़े पै…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
काम एनआईएच अनुदान आर01एनएस098804 (एईडब्ल्यू), एफ 31एनएस 113394 (यू.सी.), और ड्यूक विश्वविद्यालय के ग्रीष्मकालीन तंत्रिका विज्ञान कार्यक्रम (डीजी) द्वारा समर्थित था।
Materials
| Betadine | Purdue Production | 67618-150-17 | |
| Cemented 10 µL needle | Hamilton | 1701SN (80008) | 33 gauge, 1.27 cm (0.5 in), 4 point style |
| Chicken anti-GFP | Millipore Sigma | AB16901 | Our lab uses this antibody at a 1:1000 concentration |
| Cotton-tip applicator | |||
| Donkey anti-chicken Cy2 | Jackson ImmunoResearch | 703-225-155 | Our lab uses this antibody at a 1:500 concentration |
| Ethanol (200 proof) | Koptec | V1016 | |
| Electroporator ECM 830 | BTX Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| Fast Green FCF | Sigma | F7252-5G | |
| FUGW plasmid | Addgene | 14883 | |
| Glass slides | VWR | 48311-703 | Superfrost plus |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Heating pad | Softheat | ||
| Hoescht 33342 fluorescent dye | Invitrogen | 62249 | |
| Imaris | Bitplane | ||
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Micro cover glass | VWR | 48382-138 | |
| Nail polish | Sally Hansen | Color 109 | |
| Normal goat serum | Gibco | 16210064 | |
| O.C.T. embedding compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Olympus MVX10 Dissecting Scope | Olympus | MVX10 | |
| P200 pipette reach tip | Fisherbrand | 02-707-138 | Used for needle spacer |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| PBS pH 7.4 (10x) | Gibco | 70011-044 | |
| Simple Neurite Tracer | FIJI | https://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer:_Basic_ Instructions |
|
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Surgical tools | RWD Life Science | Small scissors and tweezers | |
| Triton X-100 | Roche | 11332481001 | non-ionic detergent |
| Tweezertrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0489 | 5 mm, platinum plated tweezer-type electrodes |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | 10977-015 | |
| Vectashield mounting media | Vectashield | H1000 | |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 1469SB | |
| Zeiss 780 Upright Confocal | Zeiss | 780 |
References
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