Utilisation de l’électroporation postnatale in vivo pour étudier la morphologie des neurones cérébelleux granulaires et le développement des synapses
Summary
Nous décrivons ici une méthode pour visualiser la synaptogenèse des neurones granulaires dans le cervelet de la souris au cours du développement cérébral postnatal lorsque ces cellules affinent leurs structures synaptiques et forment des synapses pour s’intégrer dans le circuit cérébral global.
Abstract
Les neurones subissent des changements dynamiques dans leur structure et leur fonction au cours du développement du cerveau pour former des connexions appropriées avec d’autres cellules. Le cervelet de rongeurs est un système idéal pour suivre le développement et la morphogenèse d’un seul type de cellule, le neurone granulaire cérébelleux (CGN), au fil du temps. Ici, l’électroporation in vivo des progéniteurs des neurones granulaires dans le cervelet de souris en développement a été utilisée pour marquer les cellules de manière clairsemée pour des analyses morphologiques ultérieures. L’efficacité de cette technique est démontrée dans sa capacité à mettre en évidence les étapes clés du développement de la maturation CGN, avec un accent particulier sur la formation de griffes dendritiques, qui sont des structures spécialisées où ces cellules reçoivent la majorité de leurs entrées synaptiques. En plus de fournir des instantanés des structures synaptiques CGN tout au long du développement cérébelleux, cette technique peut être adaptée pour manipuler génétiquement les neurones granulaires de manière autonome par les cellules afin d’étudier le rôle de tout gène d’intérêt et son effet sur la morphologie CGN, le développement des griffes et la synaptogenèse.
Introduction
Le développement du cerveau est un processus prolongé qui s’étend de l’embryogenèse à la vie postnatale. Pendant ce temps, le cerveau intègre une combinaison de stimuli intrinsèques et extrinsèques qui sculptent le câblage des synapses entre les dendrites et les axones pour finalement guider le comportement. Le cervelet des rongeurs est un système modèle idéal pour étudier le développement des synapses, car le développement d’un seul type de neurone, le neurone granulaire cérébelleux (CGN), peut être suivi lors de sa transition d’une cellule progénitrice à un neurone mature. Cela est dû, en partie, au fait qu’une majorité du cortex cérébelleux se développe après la naissance, ce qui permet une manipulation génétique facile et le marquage cellulaire après la naissance1.
Chez les mammifères, la différenciation CGN commence à la fin du développement embryonnaire lorsqu’un sous-ensemble de cellules prolifératives dans le cerveau postérieur migre sur la lèvre rhombique pour former une zone germinale secondaire à la surface du cervelet 2,3,4. Bien qu’elles soient pleinement engagées dans une identité de progéniteur de neurones granulaires (GNP), ces cellules continuent de proliférer dans la partie externe de la couche granulaire externe (EGL) jusqu’au jour postnatal 14 (P14). La prolifération de cette couche entraîne une expansion massive du cervelet car ces cellules donnent naissance exclusivement à CGNs5. Une fois que les CGN nouveau-nés quittent le cycle cellulaire dans l’EGL, ils migrent vers l’intérieur vers la couche granulaire interne (IGL), laissant derrière eux un axone qui bifurquera et voyagera dans la couche moléculaire du cervelet, formant des fibres parallèles qui synapsent sur les cellules de Purkinje6. La position de ces fibres dans la couche moléculaire dépend du moment de la sortie du cycle cellulaire.
Les CGN qui se différencient en premier quittent leurs fibres parallèles vers le bas de la couche moléculaire, tandis que les axones des CGN qui se différencient plus tard sont regroupés dans lehaut 7,8. Une fois que les corps cellulaires CGN atteignent l’IGL, ils commencent à élaborer des dendrites et à former des synapses avec des neurones inhibiteurs et excitateurs voisins. L’arbre dendritique mature d’une CGN présente une architecture stéréotypée avec quatre processus principaux. Au cours de la maturation CGN, les structures à l’extrémité de ces dendrites forment une griffe qui s’enrichit en protéines postsynaptiques 9,10. Ces structures spécialisées, appelées griffes dendritiques, contiennent la majorité des synapses sur les neurones granulaires et sont importantes pour recevoir à la fois les entrées excitatrices des innervations de fibres moussues provenant des pons, ainsi que les entrées inhibitrices des cellules de Golgi locales. Une fois entièrement configurées, les connexions synaptiques des CGN permettent à ces cellules de relayer les entrées des noyaux pré-cérébelleux aux cellules de Purkinje, qui se projettent hors du cortex cérébelleux vers les noyaux cérébelleux profonds.
L’électroporation postnatale in vivo des GNP est avantageuse par rapport à d’autres méthodes basées sur le marquage, telles que l’infection virale et la génération de lignées de souris transgéniques, car l’expression des constructions souhaitées peut être réalisée sur un calendrier rapide, et la méthode cible une petite population de cellules, utile pour étudier les effets autonomes cellulaires. Cette méthode a été utilisée dans des études antérieures pour étudier le développement morphologique des CGN; Cependant, ces études se sont concentrées sur un seul point temporel ou une courte fenêtre de temps 9,10,11,12,13. Cette méthode de marquage a été associée à une analyse d’images pour documenter les changements dans la morphologie CGN qui se produisent tout au long de la différenciation CGN au cours des trois premières semaines de la vie postnatale. Ces données révèlent la dynamique du développement des dendrites CGN qui sous-tend la construction des circuits cérébelleux.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les neurones granulaires cérébelleux sont les neurones les plus abondants dans le cerveau des mammifères, représentant près de 60 à 70% de la population totale de neurones dans le cerveau des rongeurs 1,14. Le cervelet a été largement utilisé pour élucider les mécanismes de prolifération cellulaire, de migration, de formation de dendrites et de développement des synapses 6,9,10,11,15,16,17,18,19,20 <sup class="xref"…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le travail a été soutenu par les subventions NIH R01NS098804 (A.E.W.), F31NS113394 (U.C.) et le programme d’été en neurosciences de l’Université Duke (D.G.).
Materials
| Betadine | Purdue Production | 67618-150-17 | |
| Cemented 10 µL needle | Hamilton | 1701SN (80008) | 33 gauge, 1.27 cm (0.5 in), 4 point style |
| Chicken anti-GFP | Millipore Sigma | AB16901 | Our lab uses this antibody at a 1:1000 concentration |
| Cotton-tip applicator | |||
| Donkey anti-chicken Cy2 | Jackson ImmunoResearch | 703-225-155 | Our lab uses this antibody at a 1:500 concentration |
| Ethanol (200 proof) | Koptec | V1016 | |
| Electroporator ECM 830 | BTX Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| Fast Green FCF | Sigma | F7252-5G | |
| FUGW plasmid | Addgene | 14883 | |
| Glass slides | VWR | 48311-703 | Superfrost plus |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Heating pad | Softheat | ||
| Hoescht 33342 fluorescent dye | Invitrogen | 62249 | |
| Imaris | Bitplane | ||
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Micro cover glass | VWR | 48382-138 | |
| Nail polish | Sally Hansen | Color 109 | |
| Normal goat serum | Gibco | 16210064 | |
| O.C.T. embedding compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Olympus MVX10 Dissecting Scope | Olympus | MVX10 | |
| P200 pipette reach tip | Fisherbrand | 02-707-138 | Used for needle spacer |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| PBS pH 7.4 (10x) | Gibco | 70011-044 | |
| Simple Neurite Tracer | FIJI | https://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer:_Basic_ Instructions |
|
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Surgical tools | RWD Life Science | Small scissors and tweezers | |
| Triton X-100 | Roche | 11332481001 | non-ionic detergent |
| Tweezertrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0489 | 5 mm, platinum plated tweezer-type electrodes |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | 10977-015 | |
| Vectashield mounting media | Vectashield | H1000 | |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 1469SB | |
| Zeiss 780 Upright Confocal | Zeiss | 780 |
References
- Altman, J., Bayer, S. A. . Development of the cerebellar system : in relation to its evolution, structure, and functions. , (1997).
- Rahimi-Balaei, M., Bergen, H., Kong, J., Marzban, H. Neuronal migration during development of the cerebellum. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 484 (2018).
- Alder, J., Cho, N. K., Hatten, M. E. Embryonic precursor cells from the rhombic lip are specified to a cerebellar granule neuron identity. Neuron. 17 (3), 389-399 (1996).
- Hatten, M. E., Heintz, N. Mechanisms of neural patterning and specification in the developing cerebellum. Annual Review of Neuroscience. 18, 385-408 (1995).
- Ben-Arie, N., et al. Math1 is essential for genesis of cerebellar granule neurons. Nature. 390 (6656), 169-172 (1997).
- Borghesani, P. R., et al. BDNF stimulates migration of cerebellar granule cells. Development. 129 (6), 1435-1442 (2002).
- Espinosa, J. S., Luo, L. Timing neurogenesis and differentiation: insights from quantitative clonal analyses of cerebellar granule cells. Journal of Neuroscience. 28 (10), 2301-2312 (2008).
- Markwalter, K. H., Yang, Y., Holy, T. E., Bonni, A. Sensorimotor coding of vermal granule neurons in the developing mammalian cerebellum. Journal of Neuroscience. 39 (34), 6626-6643 (2019).
- Shalizi, A., et al. PIASx is a MEF2 SUMO E3 ligase that promotes postsynaptic dendritic morphogenesis. Journal of Neuroscience. 27 (37), 10037-10046 (2007).
- Shalizi, A., et al. A Calcium-regulated MEF2 sumoylation switch controls poststynaptic differentiation. Science. 311 (5763), 1012-1017 (2006).
- Konishi, Y., Stegmuller, J., Matsuda, T., Bonni, S., Bonni, A. Cdh1-APC controls axonal growth and patterning in the mammalian brain. Science. 303 (5660), 1026-1030 (2004).
- Holubowska, A., Mukherjee, C., Vadhvani, M., Stegmuller, J. Genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (85), e51070 (2014).
- Yang, Y., et al. Chromatin remodeling inactivates activity genes and regulates neural coding. Science. 353 (6296), 300-305 (2016).
- Herculano-Houzel, S. Coordinated scaling of cortical and cerebellar numbers of neurons. Frontiers in Neuroanatomy. 4, 12 (2010).
- Wilson, P. M., Fryer, R. H., Fang, Y., Hatten, M. E. Astn2, a novel member of the astrotactin gene family, regulates the trafficking of ASTN1 during glial-guided neuronal migration. Journal of Neuroscience. 30 (25), 8529-8540 (2010).
- Kokubo, M., et al. BDNF-mediated cerebellar granule cell development is impaired in mice null for CaMKK2 or CaMKIV. Journal of Neuroscience. 29 (28), 8901-8913 (2009).
- Schwartz, P. M., Borghesani, P. R., Levy, R. L., Pomeroy, S. L., Segal, R. A. Abnormal cerebellar development and foliation in BDNF-/- mice reveals a role for neurotrophins in CNS patterning. Neuron. 19 (2), 269-281 (1997).
- Segal, R. A., Pomeroy, S. L., Stiles, C. D. Axonal growth and fasciculation linked to differential expression of BDNF and NT3 receptors in developing cerebellar granule cells. Journal of Neuroscience. 15 (7), 4970-4981 (1995).
- Zhou, P., et al. Polarized signaling endosomes coordinate BDNF-induced chemotaxis of cerebellar precursors. Neuron. 55 (1), 53-68 (2007).
- Dhar, M., Hantman, A. W., Nishiyama, H. Developmental pattern and structural factors of dendritic survival in cerebellar granule cells in vivo. Scientific Reports. 8 (1), 17561 (2018).
- Ito, M. Synaptic plasticity in the cerebellar cortex and its role in motor learning. Canadian Journal of Neurological Sciences. 20, 70-74 (1993).
- Jorntell, H., Hansel, C. Synaptic memories upside down: bidirectional plasticity at cerebellar parallel fiber-Purkinje cell synapses. Neuron. 52 (2), 227-238 (2006).
- Nakanishi, S. Genetic manipulation study of information processing in the cerebellum. Neurosciences. 162 (3), 723-731 (2009).
- Chang, C. H., et al. Atoh1 controls primary cilia formation to allow for SHH-triggered granule neuron progenitor proliferation. Developmental Cell. 48 (2), 184-199 (2019).
