Brug af in vivo postnatal elektroporation til at studere cerebellar granulatneuronmorfologi og synapseudvikling
Summary
Her beskriver vi en metode til at visualisere synaptogenese af granulatneuroner i muselillehjernen over tidsforløbet af postnatal hjerneudvikling, når disse celler forfiner deres synaptiske strukturer og danner synapser for at integrere sig i det samlede hjernekredsløb.
Abstract
Neuroner gennemgår dynamiske ændringer i deres struktur og funktion under hjernens udvikling for at danne passende forbindelser med andre celler. Gnaver cerebellum er et ideelt system til at spore udviklingen og morfogenesen af en enkelt celletype, cerebellar granule neuron (CGN), over tid. Her blev de vivo-elektroporation af granulatneuronprogenitorer i muselillehjernen anvendt til sparsomt at mærke celler til efterfølgende morfologiske analyser. Effektiviteten af denne teknik demonstreres i dens evne til at fremvise vigtige udviklingsstadier af CGN-modning med et specifikt fokus på dannelsen af dendritiske kløer, som er specialiserede strukturer, hvor disse celler modtager størstedelen af deres synaptiske input. Ud over at give snapshots af CGN-synaptiske strukturer gennem cerebellar udvikling, kan denne teknik tilpasses til genetisk manipulation af granulatneuroner på en celle-autonom måde for at studere rollen som ethvert gen af interesse og dets virkning på CGN-morfologi, kloudvikling og synaptogenese.
Introduction
Hjernens udvikling er en langvarig proces, der strækker sig fra embryogenese til postnatal liv. I løbet af denne tid integrerer hjernen en kombination af indre og ydre stimuli, der skulpturerer ledningerne af synapser mellem dendritter og axoner for i sidste ende at styre adfærd. Gnaver cerebellum er et ideelt modelsystem til at studere, hvordan synapser udvikler sig, fordi udviklingen af en enkelt neurontype, cerebellar granule neuron (CGN), kan spores, når den overgår fra en stamcelle til en moden neuron. Dette skyldes dels, at et flertal af cerebellar cortex udvikler sig postnatalt, hvilket giver mulighed for nem genetisk manipulation og cellemærkning efter fødslen1.
Hos pattedyr begynder CGN-differentiering i slutningen af embryonal udvikling, når en delmængde af proliferative celler i baghjernen migrerer over rombelæben for at danne en sekundær kimzone på overfladen af lillehjernen 2,3,4. Selvom de er fuldt ud forpligtet til en granulatneuron stamfader (GNP) identitet, fortsætter disse celler med at sprede sig inden for den ydre del af det eksterne granulatlag (EGL) indtil postnatal dag 14 (P14). Spredning af dette lag resulterer i en massiv udvidelse af lillehjernen, da disse celler udelukkende giver anledning til CGN’er5. Når nyfødte CGN’er forlader cellecyklussen i EGL, migrerer de indad mod det indre granulatlag (IGL) og efterlader en axon, der vil bifurcate og rejse i det molekylære lag af cerebellum og danne parallelle fibre, der synapser på Purkinje-celler6. Placeringen af disse fibre i molekyllaget afhænger af tidspunktet for cellecyklusudgang.
CGN’er, der adskiller sig først, forlader deres parallelle fibre mod bunden af molekyllaget, mens axonerne af CGN’er, der adskiller sig senere, er grupperet øverst 7,8. Når CGN-cellelegemerne når IGL, begynder de at uddybe dendritter og danne synapser med nærliggende hæmmende og excitatoriske neuroner. Det modne dendritiske træ af en CGN udviser en stereotyp arkitektur med fire hovedprocesser. I løbet af CGN-modning danner strukturerne i slutningen af disse dendritter en klo, der bliver beriget med postsynaptiske proteiner 9,10. Disse specialiserede strukturer, kaldet dendritiske kløer, indeholder størstedelen af synapserne på granulatneuroner og er vigtige for at modtage både excitatoriske input fra mossy fiberinnerveringer, der stammer fra pons, såvel som hæmmende input fra lokale Golgi-celler. Når de er fuldt konfigureret, tillader de synaptiske forbindelser af CGN’er disse celler at videresende input fra præ-cerebellære kerner til Purkinje-celler, som projicerer ud af cerebellar cortex til de dybe cerebellære kerner.
In vivo postnatal elektroporation af GNP’er er fordelagtig i forhold til andre mærkningsbaserede metoder, såsom virusinfektion og generering af transgene muselinjer, fordi ekspressionen af ønskede konstruktioner kan opnås på en hurtig tidslinje, og metoden er rettet mod en lille population af celler, der er nyttige til at studere celleautonome effekter. Denne metode er blevet anvendt i tidligere undersøgelser til at studere morfologisk udvikling af CGN’er; Disse undersøgelser har imidlertid fokuseret på enten et enkelt tidspunkt eller et kort tidsvindue 9,10,11,12,13. Denne mærkningsmetode blev parret med billedanalyse for at dokumentere ændringerne i CGN-morfologi, der forekommer på tværs af hele CGN-differentieringsforløbet i løbet af de første tre uger af det postnatale liv. Disse data afslører dynamikken i CGN-dendritudvikling, der ligger til grund for konstruktionen af cerebellære kredsløb.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cerebellære granulatneuroner er de mest rigelige neuroner i pattedyrhjernen og udgør næsten 60-70% af den samlede neuronpopulation i gnaverhjernen 1,14. Lillehjernen er blevet flittigt udnyttet til at belyse mekanismer for cellulær proliferation, migration, dendritdannelse og synapseudvikling 6,9,10,11,15,16,17,18,19,20 <…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbejdet blev støttet af NIH-tilskud R01NS098804 (A.E.W.), F31NS113394 (U.C.) og Duke University’s Summer Neuroscience Program (D.G.).
Materials
| Betadine | Purdue Production | 67618-150-17 | |
| Cemented 10 µL needle | Hamilton | 1701SN (80008) | 33 gauge, 1.27 cm (0.5 in), 4 point style |
| Chicken anti-GFP | Millipore Sigma | AB16901 | Our lab uses this antibody at a 1:1000 concentration |
| Cotton-tip applicator | |||
| Donkey anti-chicken Cy2 | Jackson ImmunoResearch | 703-225-155 | Our lab uses this antibody at a 1:500 concentration |
| Ethanol (200 proof) | Koptec | V1016 | |
| Electroporator ECM 830 | BTX Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| Fast Green FCF | Sigma | F7252-5G | |
| FUGW plasmid | Addgene | 14883 | |
| Glass slides | VWR | 48311-703 | Superfrost plus |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Heating pad | Softheat | ||
| Hoescht 33342 fluorescent dye | Invitrogen | 62249 | |
| Imaris | Bitplane | ||
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Micro cover glass | VWR | 48382-138 | |
| Nail polish | Sally Hansen | Color 109 | |
| Normal goat serum | Gibco | 16210064 | |
| O.C.T. embedding compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Olympus MVX10 Dissecting Scope | Olympus | MVX10 | |
| P200 pipette reach tip | Fisherbrand | 02-707-138 | Used for needle spacer |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| PBS pH 7.4 (10x) | Gibco | 70011-044 | |
| Simple Neurite Tracer | FIJI | https://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer:_Basic_ Instructions |
|
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Surgical tools | RWD Life Science | Small scissors and tweezers | |
| Triton X-100 | Roche | 11332481001 | non-ionic detergent |
| Tweezertrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0489 | 5 mm, platinum plated tweezer-type electrodes |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | 10977-015 | |
| Vectashield mounting media | Vectashield | H1000 | |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 1469SB | |
| Zeiss 780 Upright Confocal | Zeiss | 780 |
References
- Altman, J., Bayer, S. A. . Development of the cerebellar system : in relation to its evolution, structure, and functions. , (1997).
- Rahimi-Balaei, M., Bergen, H., Kong, J., Marzban, H. Neuronal migration during development of the cerebellum. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 484 (2018).
- Alder, J., Cho, N. K., Hatten, M. E. Embryonic precursor cells from the rhombic lip are specified to a cerebellar granule neuron identity. Neuron. 17 (3), 389-399 (1996).
- Hatten, M. E., Heintz, N. Mechanisms of neural patterning and specification in the developing cerebellum. Annual Review of Neuroscience. 18, 385-408 (1995).
- Ben-Arie, N., et al. Math1 is essential for genesis of cerebellar granule neurons. Nature. 390 (6656), 169-172 (1997).
- Borghesani, P. R., et al. BDNF stimulates migration of cerebellar granule cells. Development. 129 (6), 1435-1442 (2002).
- Espinosa, J. S., Luo, L. Timing neurogenesis and differentiation: insights from quantitative clonal analyses of cerebellar granule cells. Journal of Neuroscience. 28 (10), 2301-2312 (2008).
- Markwalter, K. H., Yang, Y., Holy, T. E., Bonni, A. Sensorimotor coding of vermal granule neurons in the developing mammalian cerebellum. Journal of Neuroscience. 39 (34), 6626-6643 (2019).
- Shalizi, A., et al. PIASx is a MEF2 SUMO E3 ligase that promotes postsynaptic dendritic morphogenesis. Journal of Neuroscience. 27 (37), 10037-10046 (2007).
- Shalizi, A., et al. A Calcium-regulated MEF2 sumoylation switch controls poststynaptic differentiation. Science. 311 (5763), 1012-1017 (2006).
- Konishi, Y., Stegmuller, J., Matsuda, T., Bonni, S., Bonni, A. Cdh1-APC controls axonal growth and patterning in the mammalian brain. Science. 303 (5660), 1026-1030 (2004).
- Holubowska, A., Mukherjee, C., Vadhvani, M., Stegmuller, J. Genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (85), e51070 (2014).
- Yang, Y., et al. Chromatin remodeling inactivates activity genes and regulates neural coding. Science. 353 (6296), 300-305 (2016).
- Herculano-Houzel, S. Coordinated scaling of cortical and cerebellar numbers of neurons. Frontiers in Neuroanatomy. 4, 12 (2010).
- Wilson, P. M., Fryer, R. H., Fang, Y., Hatten, M. E. Astn2, a novel member of the astrotactin gene family, regulates the trafficking of ASTN1 during glial-guided neuronal migration. Journal of Neuroscience. 30 (25), 8529-8540 (2010).
- Kokubo, M., et al. BDNF-mediated cerebellar granule cell development is impaired in mice null for CaMKK2 or CaMKIV. Journal of Neuroscience. 29 (28), 8901-8913 (2009).
- Schwartz, P. M., Borghesani, P. R., Levy, R. L., Pomeroy, S. L., Segal, R. A. Abnormal cerebellar development and foliation in BDNF-/- mice reveals a role for neurotrophins in CNS patterning. Neuron. 19 (2), 269-281 (1997).
- Segal, R. A., Pomeroy, S. L., Stiles, C. D. Axonal growth and fasciculation linked to differential expression of BDNF and NT3 receptors in developing cerebellar granule cells. Journal of Neuroscience. 15 (7), 4970-4981 (1995).
- Zhou, P., et al. Polarized signaling endosomes coordinate BDNF-induced chemotaxis of cerebellar precursors. Neuron. 55 (1), 53-68 (2007).
- Dhar, M., Hantman, A. W., Nishiyama, H. Developmental pattern and structural factors of dendritic survival in cerebellar granule cells in vivo. Scientific Reports. 8 (1), 17561 (2018).
- Ito, M. Synaptic plasticity in the cerebellar cortex and its role in motor learning. Canadian Journal of Neurological Sciences. 20, 70-74 (1993).
- Jorntell, H., Hansel, C. Synaptic memories upside down: bidirectional plasticity at cerebellar parallel fiber-Purkinje cell synapses. Neuron. 52 (2), 227-238 (2006).
- Nakanishi, S. Genetic manipulation study of information processing in the cerebellum. Neurosciences. 162 (3), 723-731 (2009).
- Chang, C. H., et al. Atoh1 controls primary cilia formation to allow for SHH-triggered granule neuron progenitor proliferation. Developmental Cell. 48 (2), 184-199 (2019).
