Utilizzo dell'elettroporazione postnatale in vivo per studiare la morfologia dei granuli cerebellari e lo sviluppo delle sinapsi
Summary
Qui descriviamo un metodo per visualizzare la sinaptogenesi dei neuroni granuli nel cervelletto del topo nel corso dello sviluppo postnatale del cervello quando queste cellule perfezionano le loro strutture sinaptiche e formano sinapsi per integrarsi nel circuito cerebrale generale.
Abstract
I neuroni subiscono cambiamenti dinamici nella loro struttura e funzione durante lo sviluppo del cervello per formare connessioni appropriate con altre cellule. Il cervelletto dei roditori è un sistema ideale per tracciare lo sviluppo e la morfogenesi di un singolo tipo di cellula, il neurone granulo cerebellare (CGN), nel tempo. Qui, l’elettroporazione in vivo dei progenitori dei neuroni granuli nel cervelletto di topo de via di sviluppo è stata impiegata per marcare scarsamente le cellule per le successive analisi morfologiche. L’efficacia di questa tecnica è dimostrata nella sua capacità di mostrare le fasi chiave dello sviluppo della maturazione del CGN, con un focus specifico sulla formazione di artigli dendritici, che sono strutture specializzate in cui queste cellule ricevono la maggior parte dei loro input sinaptici. Oltre a fornire istantanee delle strutture sinaptiche CGN durante lo sviluppo cerebellare, questa tecnica può essere adattata per manipolare geneticamente i neuroni granuli in modo autonomo dalla cellula per studiare il ruolo di qualsiasi gene di interesse e il suo effetto sulla morfologia CGN, sullo sviluppo degli artigli e sulla sinaptogenesi.
Introduction
Lo sviluppo del cervello è un processo prolungato che si estende dall’embriogenesi alla vita postnatale. Durante questo periodo, il cervello integra una combinazione di stimoli intrinseci ed estrinseci che scolpiscono il cablaggio delle sinapsi tra dendriti e assoni per guidare in definitiva il comportamento. Il cervelletto dei roditori è un sistema modello ideale per studiare come si sviluppano le sinapsi perché lo sviluppo di un singolo tipo di neurone, il neurone granulo cerebellare (CGN), può essere monitorato mentre passa da una cellula progenitrice a un neurone maturo. Ciò è dovuto, in parte, al fatto che la maggior parte della corteccia cerebellare si sviluppa postnatale, il che consente una facile manipolazione genetica e l’etichettatura cellulare dopo la nascita1.
Nei mammiferi, la differenziazione CGN inizia alla fine dello sviluppo embrionale quando un sottogruppo di cellule proliferative nel cervello posteriore migra sul labbro rombico per formare una zona germinale secondaria sulla superficie del cervelletto 2,3,4. Sebbene siano pienamente impegnate in un’identità progenitrice del neurone granulo (GNP), queste cellule continuano a proliferare all’interno della porzione esterna dello strato granulo esterno (EGL) fino al giorno 14 postnatale (P14). La proliferazione di questo strato provoca una massiccia espansione del cervelletto poiché queste cellule danno origine esclusivamente a CGN5. Una volta che i CGN appena nati escono dal ciclo cellulare nell’EGL, migrano verso l’interno verso lo strato di granuli interni (IGL), lasciandosi dietro un assone che si biforcherà e viaggerà nello strato molecolare del cervelletto, formando fibre parallele che sinapsi sulle cellule di Purkinje6. La posizione di queste fibre all’interno dello strato molecolare dipende dai tempi di uscita del ciclo cellulare.
I CGN che si differenziano per primi lasciano le loro fibre parallele verso il fondo dello strato molecolare, mentre gli assoni dei CGN che si differenziano in seguito sono raggruppati nella parte superiore 7,8. Una volta che i corpi delle cellule CGN raggiungono l’IGL, iniziano a elaborare dendriti e formano sinapsi con i vicini neuroni inibitori ed eccitatori. L’albero dendritico maturo di un CGN mostra un’architettura stereotipata con quattro processi principali. Nel corso della maturazione di CGN, le strutture alla fine di questi dendriti formano un artiglio che si arricchisce di proteine postsinaptiche 9,10. Queste strutture specializzate, chiamate artigli dendritici, contengono la maggior parte delle sinapsi sui neuroni granuli e sono importanti per ricevere sia input eccitatori da innervazioni di fibre muschiose provenienti dal ponte, sia input inibitori dalle cellule locali di Golgi. Una volta completamente configurate, le connessioni sinaptiche delle CGN consentono a queste cellule di trasmettere input dai nuclei pre-cerebellari alle cellule di Purkinje, che si proiettano dalla corteccia cerebellare ai nuclei cerebellari profondi.
L’elettroporazione postnatale in vivo dei PNL è vantaggiosa rispetto ad altri metodi basati sulla marcatura, come l’infezione virale e la generazione di linee di topo transgeniche, perché l’espressione dei costrutti desiderati può essere raggiunta su una linea temporale rapida e il metodo si rivolge a una piccola popolazione di cellule, utile nello studio degli effetti autonomi delle cellule. Questo metodo è stato utilizzato in studi precedenti per studiare lo sviluppo morfologico delle CGN; Tuttavia, questi studi si sono concentrati su un singolo punto temporale o su una breve finestra temporale 9,10,11,12,13. Questo metodo di etichettatura è stato abbinato all’analisi delle immagini per documentare i cambiamenti nella morfologia CGN che si verificano durante l’intero corso della differenziazione CGN nelle prime tre settimane di vita postnatale. Questi dati rivelano le dinamiche dello sviluppo di dendriti CGN che sono alla base della costruzione dei circuiti cerebellari.
Protocol
Representative Results
Discussion
I neuroni dei granuli cerebellari sono i neuroni più abbondanti nel cervello dei mammiferi, costituendo quasi il 60-70% della popolazione totale di neuroni nel cervello dei roditori 1,14. Il cervelletto è stato ampiamente utilizzato per chiarire i meccanismi di proliferazione cellulare, migrazione, formazione di dendriti e sviluppo delle sinapsi. 6,9,10,11,15,16,17,18,19,20 …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni NIH R01NS098804 (A.E.W.), F31NS113394 (U.C.) e dal Summer Neuroscience Program (D.G.) della Duke University.
Materials
| Betadine | Purdue Production | 67618-150-17 | |
| Cemented 10 µL needle | Hamilton | 1701SN (80008) | 33 gauge, 1.27 cm (0.5 in), 4 point style |
| Chicken anti-GFP | Millipore Sigma | AB16901 | Our lab uses this antibody at a 1:1000 concentration |
| Cotton-tip applicator | |||
| Donkey anti-chicken Cy2 | Jackson ImmunoResearch | 703-225-155 | Our lab uses this antibody at a 1:500 concentration |
| Ethanol (200 proof) | Koptec | V1016 | |
| Electroporator ECM 830 | BTX Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| Fast Green FCF | Sigma | F7252-5G | |
| FUGW plasmid | Addgene | 14883 | |
| Glass slides | VWR | 48311-703 | Superfrost plus |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Heating pad | Softheat | ||
| Hoescht 33342 fluorescent dye | Invitrogen | 62249 | |
| Imaris | Bitplane | ||
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Micro cover glass | VWR | 48382-138 | |
| Nail polish | Sally Hansen | Color 109 | |
| Normal goat serum | Gibco | 16210064 | |
| O.C.T. embedding compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Olympus MVX10 Dissecting Scope | Olympus | MVX10 | |
| P200 pipette reach tip | Fisherbrand | 02-707-138 | Used for needle spacer |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| PBS pH 7.4 (10x) | Gibco | 70011-044 | |
| Simple Neurite Tracer | FIJI | https://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer:_Basic_ Instructions |
|
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Surgical tools | RWD Life Science | Small scissors and tweezers | |
| Triton X-100 | Roche | 11332481001 | non-ionic detergent |
| Tweezertrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0489 | 5 mm, platinum plated tweezer-type electrodes |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | 10977-015 | |
| Vectashield mounting media | Vectashield | H1000 | |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 1469SB | |
| Zeiss 780 Upright Confocal | Zeiss | 780 |
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