소뇌 과립 뉴런 형태 및 시냅스 발달을 연구하기 위해 생체 내 출생 후 전기천공법 활용
Summary
여기에서 우리는 출생 후 뇌 발달 과정에서 마우스 소뇌에서 과립 뉴런의 시냅스 형성을 시각화하는 방법을 설명합니다.이 세포는 시냅스 구조를 개선하고 시냅스를 형성하여 전체 뇌 회로에 통합됩니다.
Abstract
뉴런은 뇌 발달 과정에서 구조와 기능에 역동적인 변화를 일으켜 다른 세포와 적절한 연결을 형성합니다. 설치류 소뇌는 시간이 지남에 따라 단일 세포 유형인 소뇌 과립 뉴런(CGN)의 발달과 형태 형성을 추적하는 이상적인 시스템입니다. 여기에서, 발달 중인 마우스 소뇌에서 과립 뉴런 전구체의 생체 내 전기천공을 사용하여 후속 형태학적 분석을 위해 세포를 드물게 라벨링했습니다. 이 기술의 효능은 CGN 성숙의 주요 발달 단계를 보여주는 능력에서 입증되며, 특히 이러한 세포가 시냅스 입력의 대부분을 받는 특수 구조인 수지상 발톱의 형성에 중점을 둡니다. 소뇌 발달 전반에 걸쳐 CGN 시냅스 구조의 스냅샷을 제공하는 것 외에도, 이 기술은 관심 유전자의 역할과 CGN 형태, 발톱 발달 및 시냅스 생성에 미치는 영향을 연구하기 위해 세포 자율적 방식으로 과립 뉴런을 유전적으로 조작하는 데 적용할 수 있습니다.
Introduction
뇌 발달은 배아 발생에서 출생 후의 삶으로 확장되는 장기간의 과정입니다. 이 기간 동안 뇌는 수상 돌기와 축삭 사이의 시냅스 배선을 조각하여 궁극적으로 행동을 유도하는 내적 자극과 외적 자극의 조합을 통합합니다. 설치류 소뇌는 단일 뉴런 유형인 소뇌 과립 뉴런(CGN)의 발달이 전구 세포에서 성숙한 뉴런으로 전환될 때 추적할 수 있기 때문에 시냅스가 어떻게 발달하는지 연구하는 이상적인 모델 시스템입니다. 이는 부분적으로는 소뇌 피질의 대부분이 출생 후 발달하여 출생 후 유전자 조작과 세포 표지가 용이하기 때문입니다1.
포유류에서 CGN 분화는 후뇌의 증식 세포 하위 집합이 마름모꼴 입술 위로 이동하여 소뇌 표면에 2차 발아 영역을 형성할 때 배아 발달이 끝날 때 시작됩니다 2,3,4. 과립 뉴런 전구체(GNP) 정체성에 완전히 전념하지만, 이 세포는 출생 후 14일(P14)까지 외부 과립층(EGL)의 바깥쪽 부분 내에서 계속 증식합니다. 이 층의 증식은 소뇌의 대규모 확장을 초래하는데, 이 세포들은 독점적으로 CGN을 생성하기 때문이다5. 신생아 CGN이 EGL에서 세포주기를 종료하면 내부 과립 층 (IGL)을 향해 안쪽으로 이동하여 소뇌의 분자 층에서 분기되고 이동하는 축삭을 남기고 Purkinje 세포에 시냅스하는 평행 섬유를 형성합니다6. 분자층 내에서 이러한 섬유의 위치는 세포주기 종료 타이밍에 따라 달라집니다.
먼저 분화하는 CGN은 분자층의 바닥을 향해 평행 섬유를 남기는 반면, 나중에 분화하는 CGN의 축삭은 상단 7,8에 클러스터링됩니다. CGN 세포체가 IGL에 도달하면 수상돌기를 정교하게 만들고 근처의 억제성 및 흥분성 뉴런과 시냅스를 형성하기 시작합니다. CGN의 성숙한 수지상 나무는 네 가지 주요 프로세스를 가진 고정 관념의 아키텍처를 보여줍니다. CGN 성숙 과정에서 이 수상돌기 끝에 있는 구조는 시냅스후 단백질 9,10이 풍부해지는 발톱을 형성합니다. 수지상 발톱이라고 하는 이러한 특수 구조는 과립 뉴런에 대한 대부분의 시냅스를 포함하며 뇌교에서 유래한 이끼 낀 섬유 신경 분포의 흥분성 입력과 국소 골지 세포의 억제 입력을 모두 수신하는 데 중요합니다. 일단 완전히 구성되면 CGN의 시냅스 연결을 통해 이러한 세포는 소뇌 전 핵에서 Purkinje 세포로 입력을 전달할 수 있으며, 이는 소뇌 피질에서 깊은 소뇌 핵으로 돌출됩니다.
GNP의 생체 내 출생 후 전기천공법은 원하는 구성물의 발현이 빠른 타임라인에서 달성될 수 있고 이 방법이 작은 세포 집단을 표적으로 하기 때문에 바이러스 감염 및 형질전환 마우스 라인의 생성과 같은 다른 표지 기반 방법보다 유리하며, 세포 자율 효과를 연구하는 데 유용합니다. 이 방법은 CGN의 형태학적 발달을 연구하기 위해 이전 연구에서 사용되었습니다. 그러나 이러한 연구는 단일 시점 또는 짧은 시간창 9,10,11,12,13에 초점을 맞췄습니다. 이 라벨링 방법은 출생 후 첫 3주 동안 CGN 분화의 전체 시간 과정에서 발생하는 CGN 형태의 변화를 문서화하기 위해 이미지 분석과 짝을 이루었습니다. 이 데이터는 소뇌 회로의 구성의 기초가 되는 CGN 수상돌기 발달의 역학을 보여줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
소뇌 과립 뉴런은 포유류 뇌에서 가장 풍부한 뉴런으로 설치류 뇌의 전체 뉴런 인구의 거의 60-70 %를 차지합니다 1,14. 소뇌는 세포 증식, 이동, 수상돌기 형성 및 시냅스 발달의 메커니즘을 밝히기 위해 광범위하게 활용되었습니다 6,9,10,11,15,16,17,18,19,20 </…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 NIH 보조금 R01NS098804 (AEW), F31NS113394 (UC) 및 Duke University의 Summer Neuroscience Program (DG)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Betadine | Purdue Production | 67618-150-17 | |
| Cemented 10 µL needle | Hamilton | 1701SN (80008) | 33 gauge, 1.27 cm (0.5 in), 4 point style |
| Chicken anti-GFP | Millipore Sigma | AB16901 | Our lab uses this antibody at a 1:1000 concentration |
| Cotton-tip applicator | |||
| Donkey anti-chicken Cy2 | Jackson ImmunoResearch | 703-225-155 | Our lab uses this antibody at a 1:500 concentration |
| Ethanol (200 proof) | Koptec | V1016 | |
| Electroporator ECM 830 | BTX Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| Fast Green FCF | Sigma | F7252-5G | |
| FUGW plasmid | Addgene | 14883 | |
| Glass slides | VWR | 48311-703 | Superfrost plus |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Heating pad | Softheat | ||
| Hoescht 33342 fluorescent dye | Invitrogen | 62249 | |
| Imaris | Bitplane | ||
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Micro cover glass | VWR | 48382-138 | |
| Nail polish | Sally Hansen | Color 109 | |
| Normal goat serum | Gibco | 16210064 | |
| O.C.T. embedding compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Olympus MVX10 Dissecting Scope | Olympus | MVX10 | |
| P200 pipette reach tip | Fisherbrand | 02-707-138 | Used for needle spacer |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| PBS pH 7.4 (10x) | Gibco | 70011-044 | |
| Simple Neurite Tracer | FIJI | https://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer:_Basic_ Instructions |
|
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Surgical tools | RWD Life Science | Small scissors and tweezers | |
| Triton X-100 | Roche | 11332481001 | non-ionic detergent |
| Tweezertrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0489 | 5 mm, platinum plated tweezer-type electrodes |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | 10977-015 | |
| Vectashield mounting media | Vectashield | H1000 | |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 1469SB | |
| Zeiss 780 Upright Confocal | Zeiss | 780 |
References
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