Bruk av in vivo postnatal elektroporering for å studere cerebellar granulatneuronmorfologi og synapseutvikling
Summary
Her beskriver vi en metode for å visualisere synaptogenese av granulatneuroner i musens lillehjerne over tidsforløpet av postnatal hjerneutvikling når disse cellene forbedrer sine synaptiske strukturer og danner synapser for å integrere seg i den generelle hjernekretsen.
Abstract
Nevroner gjennomgår dynamiske endringer i deres struktur og funksjon under hjernens utvikling for å danne passende forbindelser med andre celler. Gnagerlillehjernen er et ideelt system for å spore utvikling og morfogenese av en enkelt celletype, cerebellar granulnevronet (CGN), over tid. Her ble in vivo elektroporering av granulatnevronprogenitorer i det utviklende musens lillehjerne brukt til sparsomt å merke celler for påfølgende morfologiske analyser. Effekten av denne teknikken er demonstrert i sin evne til å vise frem viktige utviklingsstadier av CGN-modning, med et spesifikt fokus på dannelsen av dendritiske klør, som er spesialiserte strukturer der disse cellene mottar flertallet av sine synaptiske innganger. I tillegg til å gi øyeblikksbilder av CGN-synaptiske strukturer gjennom cerebellar utvikling, kan denne teknikken tilpasses for å genetisk manipulere granulatneuroner på en celleautonom måte for å studere rollen til ethvert gen av interesse og dets effekt på CGN-morfologi, kloutvikling og synaptogenese.
Introduction
Hjernens utvikling er en langvarig prosess som strekker seg fra embryogenese til postnatal liv. I løpet av denne tiden integrerer hjernen en kombinasjon av inneboende og ekstrinsiske stimuli som former ledningene til synapser mellom dendritter og axoner for til slutt å lede atferd. Gnagerlillehjernen er et ideelt modellsystem for å studere hvordan synapser utvikler seg fordi utviklingen av en enkelt nevrontype, cerebellar granulnevron (CGN), kan spores når den overgår fra en stamcelle til et modent nevron. Dette skyldes delvis det faktum at et flertall av cerebellarcortex utvikler seg postnatalt, noe som muliggjør enkel genetisk manipulering og cellemerking etter fødselen1.
Hos pattedyr begynner CGN-differensiering på slutten av embryonal utvikling når en delmengde av proliferative celler i bakhjernen migrerer over den rombiske leppen for å danne en sekundær germinal sone på overflaten av cerebellum 2,3,4. Selv om de er fullt forpliktet til en granulatnevronprogenitoridentitet (BNP), fortsetter disse cellene å proliferere i den ytre delen av det ytre granulatlaget (EGL) til postnatal dag 14 (P14). Spredning av dette laget resulterer i en massiv utvidelse av lillehjernen da disse cellene gir opphav utelukkende til CGN5. Når nyfødte CGN-er forlater cellesyklusen i EGL, migrerer de innover mot det indre granulatlaget (IGL), og etterlater et axon som vil fordele seg og bevege seg i det molekylære laget av cerebellum, og danne parallelle fibre som synapser på Purkinje-celler6. Plasseringen av disse fibrene i molekyllaget er avhengig av tidspunktet for cellesyklusutgang.
CGN-er som differensierer først, forlater sine parallelle fibre mot bunnen av molekyllaget, mens aksonene til CGN-er som skiller seg senere, er gruppert på toppen 7,8. Når CGN-cellelegemene når IGL, begynner de å utarbeide dendritter og danne synapser med nærliggende hemmende og eksitatoriske nevroner. Det modne dendrittiske treet til en CGN viser en stereotyp arkitektur med fire hovedprosesser. I løpet av CGN-modning danner strukturene på slutten av disse dendrittene en klo som blir beriket med postsynaptiske proteiner 9,10. Disse spesialiserte strukturene, kalt dendrittiske klør, inneholder flertallet av synapsene på granulatneuroner og er viktige for å motta både eksitatoriske innganger fra mosefiberinnerveringer som stammer fra pons, samt hemmende innganger fra lokale Golgi-celler. Når de er fullstendig konfigurert, tillater de synaptiske forbindelsene til CGN-er disse cellene å videresende innganger fra pre-cerebellare kjerner til Purkinje-celler, som projiserer ut av cerebellar cortex til de dype cerebellare kjernene.
In vivo postnatal elektroporering av BNP er fordelaktig i forhold til andre merkingsbaserte metoder, for eksempel virusinfeksjon og generering av transgene muselinjer, fordi uttrykket av ønskede konstruksjoner kan oppnås på en rask tidslinje, og metoden retter seg mot en liten populasjon av celler, som er nyttige for å studere celleautonome effekter. Denne metoden har blitt brukt i tidligere studier for å studere morfologisk utvikling av CGN; Imidlertid har disse studiene fokusert på enten et enkelt tidspunkt eller et kort tidsvindu 9,10,11,12,13. Denne merkemetoden ble parret med bildeanalyse for å dokumentere endringene i CGN-morfologi som forekommer over hele tidsforløpet av CGN-differensiering i løpet av de første tre ukene av postnatallivet. Disse dataene avslører dynamikken i CGN-dendrittutvikling som ligger til grunn for konstruksjon av cerebellarkretser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cerebellar granulatneuroner er de mest tallrike nevronene i pattedyrhjernen, og utgjør nesten 60-70% av den totale nevronpopulasjonen i gnagerhjernen 1,14. Lillehjernen har blitt mye brukt for å belyse mekanismer for cellulær proliferasjon, migrasjon, dendrittdannelse og synapseutvikling 6,9,10,11,15,16,17,18,19,20 <sup cl…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbeidet ble støttet av NIH-tilskudd R01NS098804 (AEW), F31NS113394 (UC) og Duke Universitys Summer Neuroscience Program (DG).
Materials
| Betadine | Purdue Production | 67618-150-17 | |
| Cemented 10 µL needle | Hamilton | 1701SN (80008) | 33 gauge, 1.27 cm (0.5 in), 4 point style |
| Chicken anti-GFP | Millipore Sigma | AB16901 | Our lab uses this antibody at a 1:1000 concentration |
| Cotton-tip applicator | |||
| Donkey anti-chicken Cy2 | Jackson ImmunoResearch | 703-225-155 | Our lab uses this antibody at a 1:500 concentration |
| Ethanol (200 proof) | Koptec | V1016 | |
| Electroporator ECM 830 | BTX Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| Fast Green FCF | Sigma | F7252-5G | |
| FUGW plasmid | Addgene | 14883 | |
| Glass slides | VWR | 48311-703 | Superfrost plus |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Heating pad | Softheat | ||
| Hoescht 33342 fluorescent dye | Invitrogen | 62249 | |
| Imaris | Bitplane | ||
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Micro cover glass | VWR | 48382-138 | |
| Nail polish | Sally Hansen | Color 109 | |
| Normal goat serum | Gibco | 16210064 | |
| O.C.T. embedding compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Olympus MVX10 Dissecting Scope | Olympus | MVX10 | |
| P200 pipette reach tip | Fisherbrand | 02-707-138 | Used for needle spacer |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| PBS pH 7.4 (10x) | Gibco | 70011-044 | |
| Simple Neurite Tracer | FIJI | https://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer:_Basic_ Instructions |
|
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Surgical tools | RWD Life Science | Small scissors and tweezers | |
| Triton X-100 | Roche | 11332481001 | non-ionic detergent |
| Tweezertrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0489 | 5 mm, platinum plated tweezer-type electrodes |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | 10977-015 | |
| Vectashield mounting media | Vectashield | H1000 | |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 1469SB | |
| Zeiss 780 Upright Confocal | Zeiss | 780 |
References
- Altman, J., Bayer, S. A. . Development of the cerebellar system : in relation to its evolution, structure, and functions. , (1997).
- Rahimi-Balaei, M., Bergen, H., Kong, J., Marzban, H. Neuronal migration during development of the cerebellum. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 484 (2018).
- Alder, J., Cho, N. K., Hatten, M. E. Embryonic precursor cells from the rhombic lip are specified to a cerebellar granule neuron identity. Neuron. 17 (3), 389-399 (1996).
- Hatten, M. E., Heintz, N. Mechanisms of neural patterning and specification in the developing cerebellum. Annual Review of Neuroscience. 18, 385-408 (1995).
- Ben-Arie, N., et al. Math1 is essential for genesis of cerebellar granule neurons. Nature. 390 (6656), 169-172 (1997).
- Borghesani, P. R., et al. BDNF stimulates migration of cerebellar granule cells. Development. 129 (6), 1435-1442 (2002).
- Espinosa, J. S., Luo, L. Timing neurogenesis and differentiation: insights from quantitative clonal analyses of cerebellar granule cells. Journal of Neuroscience. 28 (10), 2301-2312 (2008).
- Markwalter, K. H., Yang, Y., Holy, T. E., Bonni, A. Sensorimotor coding of vermal granule neurons in the developing mammalian cerebellum. Journal of Neuroscience. 39 (34), 6626-6643 (2019).
- Shalizi, A., et al. PIASx is a MEF2 SUMO E3 ligase that promotes postsynaptic dendritic morphogenesis. Journal of Neuroscience. 27 (37), 10037-10046 (2007).
- Shalizi, A., et al. A Calcium-regulated MEF2 sumoylation switch controls poststynaptic differentiation. Science. 311 (5763), 1012-1017 (2006).
- Konishi, Y., Stegmuller, J., Matsuda, T., Bonni, S., Bonni, A. Cdh1-APC controls axonal growth and patterning in the mammalian brain. Science. 303 (5660), 1026-1030 (2004).
- Holubowska, A., Mukherjee, C., Vadhvani, M., Stegmuller, J. Genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (85), e51070 (2014).
- Yang, Y., et al. Chromatin remodeling inactivates activity genes and regulates neural coding. Science. 353 (6296), 300-305 (2016).
- Herculano-Houzel, S. Coordinated scaling of cortical and cerebellar numbers of neurons. Frontiers in Neuroanatomy. 4, 12 (2010).
- Wilson, P. M., Fryer, R. H., Fang, Y., Hatten, M. E. Astn2, a novel member of the astrotactin gene family, regulates the trafficking of ASTN1 during glial-guided neuronal migration. Journal of Neuroscience. 30 (25), 8529-8540 (2010).
- Kokubo, M., et al. BDNF-mediated cerebellar granule cell development is impaired in mice null for CaMKK2 or CaMKIV. Journal of Neuroscience. 29 (28), 8901-8913 (2009).
- Schwartz, P. M., Borghesani, P. R., Levy, R. L., Pomeroy, S. L., Segal, R. A. Abnormal cerebellar development and foliation in BDNF-/- mice reveals a role for neurotrophins in CNS patterning. Neuron. 19 (2), 269-281 (1997).
- Segal, R. A., Pomeroy, S. L., Stiles, C. D. Axonal growth and fasciculation linked to differential expression of BDNF and NT3 receptors in developing cerebellar granule cells. Journal of Neuroscience. 15 (7), 4970-4981 (1995).
- Zhou, P., et al. Polarized signaling endosomes coordinate BDNF-induced chemotaxis of cerebellar precursors. Neuron. 55 (1), 53-68 (2007).
- Dhar, M., Hantman, A. W., Nishiyama, H. Developmental pattern and structural factors of dendritic survival in cerebellar granule cells in vivo. Scientific Reports. 8 (1), 17561 (2018).
- Ito, M. Synaptic plasticity in the cerebellar cortex and its role in motor learning. Canadian Journal of Neurological Sciences. 20, 70-74 (1993).
- Jorntell, H., Hansel, C. Synaptic memories upside down: bidirectional plasticity at cerebellar parallel fiber-Purkinje cell synapses. Neuron. 52 (2), 227-238 (2006).
- Nakanishi, S. Genetic manipulation study of information processing in the cerebellum. Neurosciences. 162 (3), 723-731 (2009).
- Chang, C. H., et al. Atoh1 controls primary cilia formation to allow for SHH-triggered granule neuron progenitor proliferation. Developmental Cell. 48 (2), 184-199 (2019).
