Utilizando a eletroporação pós-natal in vivo para estudar a morfologia do neurônio do grânulo cerebelar e o desenvolvimento da sinapse
Summary
Aqui descrevemos um método para visualizar a sinaptogênese de neurônios de grânulos no cerebelo do rato ao longo do curso de tempo do desenvolvimento cerebral pós-natal, quando essas células refinam suas estruturas sinápticas e formam sinapses para se integrarem ao circuito cerebral geral.
Abstract
Os neurônios sofrem mudanças dinâmicas em sua estrutura e função durante o desenvolvimento do cérebro para formar conexões apropriadas com outras células. O cerebelo de roedores é um sistema ideal para rastrear o desenvolvimento e a morfogênese de um único tipo de célula, o neurônio do grânulo cerebelar (CGN), ao longo do tempo. Aqui, a eletroporação in vivo de progenitores de neurônios de grânulos no cerebelo de camundongos em desenvolvimento foi empregada para marcar esparsamente as células para análises morfológicas subsequentes. A eficácia desta técnica é demonstrada em sua capacidade de mostrar os principais estágios de desenvolvimento da maturação do CGN, com um foco específico na formação de garras dendríticas, que são estruturas especializadas onde essas células recebem a maioria de suas entradas sinápticas. Além de fornecer instantâneos das estruturas sinápticas da CGN ao longo do desenvolvimento cerebelar, esta técnica pode ser adaptada para manipular geneticamente os neurônios dos grânulos de maneira autônoma celular para estudar o papel de qualquer gene de interesse e seu efeito na morfologia da CGN, no desenvolvimento de garras e na sinaptogênese.
Introduction
O desenvolvimento do cérebro é um processo prolongado que se estende desde a embriogênese até a vida pós-natal. Durante esse tempo, o cérebro integra uma combinação de estímulos intrínsecos e extrínsecos que esculpem a fiação das sinapses entre dendritos e axônios para, finalmente, orientar o comportamento. O cerebelo de roedores é um sistema modelo ideal para estudar como as sinapses se desenvolvem porque o desenvolvimento de um único tipo de neurônio, o neurônio do grânulo cerebelar (CGN), pode ser rastreado à medida que transita de uma célula progenitora para um neurônio maduro. Isso se deve, em parte, ao fato de que a maioria do córtex cerebelar se desenvolve no pós-natal, o que permite fácil manipulação genética e marcação celular após o nascimento1.
Em mamíferos, a diferenciação de CGN começa no final do desenvolvimento embrionário, quando um subconjunto de células proliferativas no rombencéfalo migra sobre o lábio rômbico para formar uma zona germinativa secundária na superfície do cerebelo 2,3,4. Embora estejam totalmente comprometidas com uma identidade de progenitor de neurônios de grânulos (PNB), essas células continuam a proliferar dentro da porção externa da camada externa de grânulos (EGL) até o dia 14 pós-natal (P14). A proliferação dessa camada resulta em uma expansão maciça do cerebelo, pois essas células dão origem exclusivamente a CGNs5. Uma vez que os CGNs recém-nascidos saem do ciclo celular no EGL, eles migram para dentro em direção à camada interna de grânulos (IGL), deixando para trás um axônio que se bifurcará e viajará na camada molecular do cerebelo, formando fibras paralelas que fazem sinapse nas células de Purkinje6. A posição dessas fibras dentro da camada molecular depende do tempo de saída do ciclo celular.
Os CGNs que se diferenciam primeiro deixam suas fibras paralelas em direção ao fundo da camada molecular, enquanto os axônios dos CGNs que se diferenciam posteriormente são agrupados no topo 7,8. Uma vez que os corpos celulares CGN atingem o IGL, eles começam a elaborar dendritos e formar sinapses com neurônios inibitórios e excitatórios próximos. A árvore dendrítica madura de um CGN exibe uma arquitetura estereotipada com quatro processos principais. Ao longo da maturação da CGN, as estruturas no final desses dendritos formam uma garra que se torna enriquecida com proteínas pós-sinápticas 9,10. Essas estruturas especializadas, chamadas garras dendríticas, contêm a maioria das sinapses nos neurônios dos grânulos e são importantes para receber tanto entradas excitatórias de inervações de fibras musgosas originárias da ponte, bem como entradas inibitórias de células locais de Golgi. Uma vez totalmente configuradas, as conexões sinápticas dos CGNs permitem que essas células retransmitam entradas de núcleos pré-cerebelares para células de Purkinje, que se projetam do córtex cerebelar para os núcleos cerebelares profundos.
A eletroporação pós-natal in vivo de PNB é vantajosa em relação a outros métodos baseados em marcação, como infecção viral e geração de linhagens transgênicas de camundongos, porque a expressão das construções desejadas pode ser alcançada em uma linha do tempo rápida, e o método tem como alvo uma pequena população de células, útil no estudo dos efeitos autônomos celulares. Este método já foi utilizado em estudos prévios para estudar o desenvolvimento morfológico de CGNs; no entanto, esses estudos têm se concentrado em um único ponto de tempo ou em uma curta janela de tempo 9,10,11,12,13. Este método de marcação foi emparelhado com a análise de imagens para documentar as mudanças na morfologia do CGN que ocorrem ao longo de todo o curso de tempo da diferenciação do CGN nas primeiras três semanas de vida pós-natal. Esses dados revelam a dinâmica do desenvolvimento de dendritos CGN subjacentes à construção de circuitos cerebelares.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os neurônios dos grânulos cerebelares são os neurônios mais abundantes no cérebro dos mamíferos, representando quase 60-70% da população total de neurônios no cérebro de roedores 1,14. O cerebelo tem sido amplamente utilizado para elucidar mecanismos de proliferação celular, migração, formação de dendritos e desenvolvimento de sinapses 6,9,10,11,15,16,17,18,19,20 <sup class="xre…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O trabalho foi apoiado pelos subsídios do NIH R01NS098804 (A.E.W.), F31NS113394 (U.C.) e Programa de Neurociência de Verão da Duke University (D.G.).
Materials
| Betadine | Purdue Production | 67618-150-17 | |
| Cemented 10 µL needle | Hamilton | 1701SN (80008) | 33 gauge, 1.27 cm (0.5 in), 4 point style |
| Chicken anti-GFP | Millipore Sigma | AB16901 | Our lab uses this antibody at a 1:1000 concentration |
| Cotton-tip applicator | |||
| Donkey anti-chicken Cy2 | Jackson ImmunoResearch | 703-225-155 | Our lab uses this antibody at a 1:500 concentration |
| Ethanol (200 proof) | Koptec | V1016 | |
| Electroporator ECM 830 | BTX Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| Fast Green FCF | Sigma | F7252-5G | |
| FUGW plasmid | Addgene | 14883 | |
| Glass slides | VWR | 48311-703 | Superfrost plus |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Heating pad | Softheat | ||
| Hoescht 33342 fluorescent dye | Invitrogen | 62249 | |
| Imaris | Bitplane | ||
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Micro cover glass | VWR | 48382-138 | |
| Nail polish | Sally Hansen | Color 109 | |
| Normal goat serum | Gibco | 16210064 | |
| O.C.T. embedding compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Olympus MVX10 Dissecting Scope | Olympus | MVX10 | |
| P200 pipette reach tip | Fisherbrand | 02-707-138 | Used for needle spacer |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| PBS pH 7.4 (10x) | Gibco | 70011-044 | |
| Simple Neurite Tracer | FIJI | https://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer:_Basic_ Instructions |
|
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Surgical tools | RWD Life Science | Small scissors and tweezers | |
| Triton X-100 | Roche | 11332481001 | non-ionic detergent |
| Tweezertrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0489 | 5 mm, platinum plated tweezer-type electrodes |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | 10977-015 | |
| Vectashield mounting media | Vectashield | H1000 | |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 1469SB | |
| Zeiss 780 Upright Confocal | Zeiss | 780 |
References
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