Использование постнатальной электропорации in vivo для изучения морфологии нейронов мозжечковых гранул и развития синапсов
Summary
Здесь мы описываем метод визуализации синаптогенеза гранулярных нейронов в мозжечке мыши в течение периода постнатального развития мозга, когда эти клетки уточняют свои синаптические структуры и образуют синапсы, чтобы интегрироваться в общую цепь мозга.
Abstract
Нейроны претерпевают динамические изменения в своей структуре и функционируют во время развития мозга, образуя соответствующие связи с другими клетками. Мозжечок грызунов является идеальной системой для отслеживания развития и морфогенеза одного типа клеток, мозжечкового гранулярного нейрона (CGN), во времени. Здесь in vivo была использована электропорация предшественников гранулярных нейронов в развивающемся мозжечке мыши для редкой маркировки клеток для последующего морфологического анализа. Эффективность этого метода продемонстрирована в его способности демонстрировать ключевые стадии развития созревания CGN с особым акцентом на формирование дендритных когтей, которые представляют собой специализированные структуры, в которых эти клетки получают большую часть своих синаптических входов. В дополнение к предоставлению снимков синаптических структур CGN на протяжении всего развития мозжечка, этот метод может быть адаптирован для генетического манипулирования гранулярными нейронами клеточно-автономным образом для изучения роли любого интересующего гена и его влияния на морфологию CGN, развитие когтей и синаптогенез.
Introduction
Развитие мозга – это длительный процесс, который простирается от эмбриогенеза до постнатальной жизни. В течение этого времени мозг интегрирует комбинацию внутренних и внешних стимулов, которые формируют проводку синапсов между дендритами и аксонами, чтобы в конечном итоге направлять поведение. Мозжечок грызунов является идеальной модельной системой для изучения того, как развиваются синапсы, потому что развитие одного типа нейронов, мозжечкового гранулярного нейрона (CGN), можно отслеживать, когда он переходит от клетки-предшественника к зрелому нейрону. Отчасти это связано с тем, что большая часть коры мозжечка развивается постнатально, что позволяет легко проводить генетические манипуляции и маркировку клеток после рождения1.
У млекопитающих дифференцировка CGN начинается в конце эмбрионального развития, когда подмножество пролиферативных клеток в заднем мозге мигрирует через ромбическую губу, образуя вторичную зародышевую зону на поверхности мозжечка 2,3,4. Несмотря на то, что они полностью привержены идентичности предшественника гранулярных нейронов (GNP), эти клетки продолжают пролиферировать во внешней части внешнего слоя гранул (EGL) до 14-го дня после рождения (P14). Пролиферация этого слоя приводит к массивному расширению мозжечка, поскольку эти клетки дают начало исключительно CGN5. Как только новорожденные CGN выходят из клеточного цикла в EGL, они мигрируют внутрь к внутреннему слою гранул (IGL), оставляя после себя аксон, который раздваивается и перемещается в молекулярном слое мозжечка, образуя параллельные волокна, которые синапсы на клетках Пуркинье6. Положение этих волокон в молекулярном слое зависит от времени выхода из клеточного цикла.
CGN, которые дифференцируются первыми, оставляют свои параллельные волокна к нижней части молекулярного слоя, тогда как аксоны CGN, которые дифференцируются позже, группируются в верхнейчасти 7,8. Как только клеточные тела CGN достигают IGL, они начинают развивать дендриты и образовывать синапсы с близлежащими тормозными и возбуждающими нейронами. Зрелое дендритное дерево CGN демонстрирует стереотипную архитектуру с четырьмя основными процессами. В ходе созревания CGN структуры на концах этих дендритов образуют коготь, который обогащается постсинаптическими белками 9,10. Эти специализированные структуры, называемые дендритными когтями, содержат большинство синапсов на гранулярных нейронах и важны для получения как возбуждающих входов от иннерваций мшистых волокон, происходящих из моста, так и ингибирующих входов от местных клеток Гольджи. После полной настройки синаптические связи CGN позволяют этим клеткам передавать входные сигналы от предмозжечковых ядер к клеткам Пуркинье, которые проецируются из коры мозжечка в глубокие ядра мозжечка.
Постнатальная электропорация GNP in vivo является преимуществом по сравнению с другими методами, основанными на маркировке, такими как вирусная инфекция и генерация трансгенных линий мышей, поскольку экспрессия желаемых конструкций может быть достигнута в короткие сроки, и метод нацелен на небольшую популяцию клеток, что полезно для изучения клеточно-автономных эффектов. Этот метод использовался в предыдущих исследованиях для изучения морфологического развития CGN; Однако эти исследования были сосредоточены либо на одном моменте времени, либо на коротком промежутке времени 9,10,11,12,13. Этот метод маркировки был сопряжен с анализом изображений для документирования изменений в морфологии CGN, которые происходят на протяжении всего периода дифференцировки CGN в течение первых трех недель постнатальной жизни. Эти данные раскрывают динамику развития дендритов CGN, лежащих в основе построения мозжечковых контуров.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мозжечковые гранулярные нейроны являются наиболее распространенными нейронами в мозге млекопитающих, составляя почти 60-70% от общей популяции нейронов в мозге грызунов 1,14. Мозжечок широко использовался для выяснения механизмов клеточной пролиферации, ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Работа была поддержана грантами NIH R01NS098804 (A.E.W.), F31NS113394 (U.C.) и Летней программой неврологии Университета Дьюка (D.G.).
Materials
| Betadine | Purdue Production | 67618-150-17 | |
| Cemented 10 µL needle | Hamilton | 1701SN (80008) | 33 gauge, 1.27 cm (0.5 in), 4 point style |
| Chicken anti-GFP | Millipore Sigma | AB16901 | Our lab uses this antibody at a 1:1000 concentration |
| Cotton-tip applicator | |||
| Donkey anti-chicken Cy2 | Jackson ImmunoResearch | 703-225-155 | Our lab uses this antibody at a 1:500 concentration |
| Ethanol (200 proof) | Koptec | V1016 | |
| Electroporator ECM 830 | BTX Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| Fast Green FCF | Sigma | F7252-5G | |
| FUGW plasmid | Addgene | 14883 | |
| Glass slides | VWR | 48311-703 | Superfrost plus |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Heating pad | Softheat | ||
| Hoescht 33342 fluorescent dye | Invitrogen | 62249 | |
| Imaris | Bitplane | ||
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Micro cover glass | VWR | 48382-138 | |
| Nail polish | Sally Hansen | Color 109 | |
| Normal goat serum | Gibco | 16210064 | |
| O.C.T. embedding compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Olympus MVX10 Dissecting Scope | Olympus | MVX10 | |
| P200 pipette reach tip | Fisherbrand | 02-707-138 | Used for needle spacer |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| PBS pH 7.4 (10x) | Gibco | 70011-044 | |
| Simple Neurite Tracer | FIJI | https://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer:_Basic_ Instructions |
|
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Surgical tools | RWD Life Science | Small scissors and tweezers | |
| Triton X-100 | Roche | 11332481001 | non-ionic detergent |
| Tweezertrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0489 | 5 mm, platinum plated tweezer-type electrodes |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | 10977-015 | |
| Vectashield mounting media | Vectashield | H1000 | |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 1469SB | |
| Zeiss 780 Upright Confocal | Zeiss | 780 |
References
- Altman, J., Bayer, S. A. . Development of the cerebellar system : in relation to its evolution, structure, and functions. , (1997).
- Rahimi-Balaei, M., Bergen, H., Kong, J., Marzban, H. Neuronal migration during development of the cerebellum. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 484 (2018).
- Alder, J., Cho, N. K., Hatten, M. E. Embryonic precursor cells from the rhombic lip are specified to a cerebellar granule neuron identity. Neuron. 17 (3), 389-399 (1996).
- Hatten, M. E., Heintz, N. Mechanisms of neural patterning and specification in the developing cerebellum. Annual Review of Neuroscience. 18, 385-408 (1995).
- Ben-Arie, N., et al. Math1 is essential for genesis of cerebellar granule neurons. Nature. 390 (6656), 169-172 (1997).
- Borghesani, P. R., et al. BDNF stimulates migration of cerebellar granule cells. Development. 129 (6), 1435-1442 (2002).
- Espinosa, J. S., Luo, L. Timing neurogenesis and differentiation: insights from quantitative clonal analyses of cerebellar granule cells. Journal of Neuroscience. 28 (10), 2301-2312 (2008).
- Markwalter, K. H., Yang, Y., Holy, T. E., Bonni, A. Sensorimotor coding of vermal granule neurons in the developing mammalian cerebellum. Journal of Neuroscience. 39 (34), 6626-6643 (2019).
- Shalizi, A., et al. PIASx is a MEF2 SUMO E3 ligase that promotes postsynaptic dendritic morphogenesis. Journal of Neuroscience. 27 (37), 10037-10046 (2007).
- Shalizi, A., et al. A Calcium-regulated MEF2 sumoylation switch controls poststynaptic differentiation. Science. 311 (5763), 1012-1017 (2006).
- Konishi, Y., Stegmuller, J., Matsuda, T., Bonni, S., Bonni, A. Cdh1-APC controls axonal growth and patterning in the mammalian brain. Science. 303 (5660), 1026-1030 (2004).
- Holubowska, A., Mukherjee, C., Vadhvani, M., Stegmuller, J. Genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (85), e51070 (2014).
- Yang, Y., et al. Chromatin remodeling inactivates activity genes and regulates neural coding. Science. 353 (6296), 300-305 (2016).
- Herculano-Houzel, S. Coordinated scaling of cortical and cerebellar numbers of neurons. Frontiers in Neuroanatomy. 4, 12 (2010).
- Wilson, P. M., Fryer, R. H., Fang, Y., Hatten, M. E. Astn2, a novel member of the astrotactin gene family, regulates the trafficking of ASTN1 during glial-guided neuronal migration. Journal of Neuroscience. 30 (25), 8529-8540 (2010).
- Kokubo, M., et al. BDNF-mediated cerebellar granule cell development is impaired in mice null for CaMKK2 or CaMKIV. Journal of Neuroscience. 29 (28), 8901-8913 (2009).
- Schwartz, P. M., Borghesani, P. R., Levy, R. L., Pomeroy, S. L., Segal, R. A. Abnormal cerebellar development and foliation in BDNF-/- mice reveals a role for neurotrophins in CNS patterning. Neuron. 19 (2), 269-281 (1997).
- Segal, R. A., Pomeroy, S. L., Stiles, C. D. Axonal growth and fasciculation linked to differential expression of BDNF and NT3 receptors in developing cerebellar granule cells. Journal of Neuroscience. 15 (7), 4970-4981 (1995).
- Zhou, P., et al. Polarized signaling endosomes coordinate BDNF-induced chemotaxis of cerebellar precursors. Neuron. 55 (1), 53-68 (2007).
- Dhar, M., Hantman, A. W., Nishiyama, H. Developmental pattern and structural factors of dendritic survival in cerebellar granule cells in vivo. Scientific Reports. 8 (1), 17561 (2018).
- Ito, M. Synaptic plasticity in the cerebellar cortex and its role in motor learning. Canadian Journal of Neurological Sciences. 20, 70-74 (1993).
- Jorntell, H., Hansel, C. Synaptic memories upside down: bidirectional plasticity at cerebellar parallel fiber-Purkinje cell synapses. Neuron. 52 (2), 227-238 (2006).
- Nakanishi, S. Genetic manipulation study of information processing in the cerebellum. Neurosciences. 162 (3), 723-731 (2009).
- Chang, C. H., et al. Atoh1 controls primary cilia formation to allow for SHH-triggered granule neuron progenitor proliferation. Developmental Cell. 48 (2), 184-199 (2019).
