Utilización de electroporación postnatal in vivo para estudiar la morfología de la neurona del gránulo cerebeloso y el desarrollo de la sinapsis
Summary
Aquí describimos un método para visualizar la sinaptogénesis de las neuronas granulares en el cerebelo del ratón durante el curso del desarrollo cerebral postnatal cuando estas células refinan sus estructuras sinápticas y forman sinapsis para integrarse en el circuito cerebral general.
Abstract
Las neuronas experimentan cambios dinámicos en su estructura y función durante el desarrollo del cerebro para formar conexiones apropiadas con otras células. El cerebelo de roedores es un sistema ideal para rastrear el desarrollo y la morfogénesis de un solo tipo de célula, la neurona granulosa cerebelosa (CGN), a través del tiempo. Aquí, la electroporación in vivo de progenitores de neuronas granulares en el cerebelo de ratón en desarrollo se empleó para etiquetar escasamente las células para análisis morfológicos posteriores. La eficacia de esta técnica se demuestra en su capacidad para mostrar las etapas clave del desarrollo de la maduración de CGN, con un enfoque específico en la formación de garras dendríticas, que son estructuras especializadas donde estas células reciben la mayoría de sus entradas sinápticas. Además de proporcionar instantáneas de las estructuras sinápticas de CGN a lo largo del desarrollo cerebeloso, esta técnica se puede adaptar para manipular genéticamente las neuronas granulares de manera autónoma celular para estudiar el papel de cualquier gen de interés y su efecto en la morfología de CGN, el desarrollo de garras y la sinaptogénesis.
Introduction
El desarrollo del cerebro es un proceso prolongado que se extiende desde la embriogénesis hasta la vida postnatal. Durante este tiempo, el cerebro integra una combinación de estímulos intrínsecos y extrínsecos que esculpen el cableado de las sinapsis entre las dendritas y los axones para guiar finalmente el comportamiento. El cerebelo de roedores es un sistema modelo ideal para estudiar cómo se desarrollan las sinapsis porque el desarrollo de un solo tipo de neurona, la neurona granular cerebelosa (CGN), se puede rastrear a medida que pasa de una célula progenitora a una neurona madura. Esto se debe, en parte, al hecho de que la mayoría de la corteza cerebelosa se desarrolla postnatalmente, lo que permite una fácil manipulación genética y etiquetado celular después del nacimiento1.
En los mamíferos, la diferenciación de CGN comienza al final del desarrollo embrionario cuando un subconjunto de células proliferativas en el cerebro posterior migra sobre el labio rómbico para formar una zona germinal secundaria en la superficie del cerebelo 2,3,4. Aunque están totalmente comprometidas con una identidad progenitora de neuronas granulares (GNP), estas células continúan proliferando dentro de la porción externa de la capa granular externa (EGL) hasta el día postnatal 14 (P14). La proliferación de esta capa resulta en una expansión masiva del cerebelo ya que estas células dan lugar exclusivamente a CGNs5. Una vez que las CGN recién nacidas salen del ciclo celular en el EGL, migran hacia el interior hacia la capa granular interna (IGL), dejando atrás un axón que se bifurcará y viajará en la capa molecular del cerebelo, formando fibras paralelas que hacen sinapsis en las células de Purkinje6. La posición de estas fibras dentro de la capa molecular depende del momento de la salida del ciclo celular.
Las CGN que se diferencian primero dejan sus fibras paralelas hacia la parte inferior de la capa molecular, mientras que los axones de CGN que se diferencian más tarde se agrupan en la parte superior 7,8. Una vez que los cuerpos celulares CGN alcanzan el IGL, comienzan a elaborar dendritas y forman sinapsis con neuronas inhibitorias y excitatorias cercanas. El árbol dendrítico maduro de un CGN exhibe una arquitectura estereotipada con cuatro procesos principales. En el transcurso de la maduración de CGN, las estructuras al final de estas dendritas forman una garra que se enriquece con proteínas postsinápticas 9,10. Estas estructuras especializadas, llamadas garras dendríticas, contienen la mayoría de las sinapsis en las neuronas granulares y son importantes para recibir tanto entradas excitatorias de inervaciones de fibras musgosas que se originan en la protuberancia, como entradas inhibitorias de células locales de Golgi. Una vez configuradas completamente, las conexiones sinápticas de las CGN permiten que estas células transmitan entradas desde los núcleos precerebelosos a las células de Purkinje, que se proyectan desde la corteza cerebelosa hacia los núcleos cerebelosos profundos.
La electroporación postnatal in vivo de los PNB es ventajosa sobre otros métodos basados en el etiquetado, como la infección viral y la generación de líneas de ratón transgénico, porque la expresión de las construcciones deseadas se puede lograr en una línea de tiempo rápida, y el método se dirige a una pequeña población de células, útil para estudiar los efectos autónomos celulares. Este método se ha utilizado en estudios previos para estudiar el desarrollo morfológico de las CGN; Sin embargo, estos estudios se han centrado en un solo punto de tiempo o en una ventana corta de tiempo 9,10,11,12,13. Este método de etiquetado se combinó con el análisis de imágenes para documentar los cambios en la morfología de CGN que ocurren a lo largo de todo el curso de tiempo de la diferenciación de CGN durante las primeras tres semanas de vida postnatal. Estos datos revelan la dinámica del desarrollo de las dendritas CGN que subyacen a la construcción de los circuitos cerebelosos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las neuronas granulares cerebelosas son las neuronas más abundantes en el cerebro de los mamíferos, constituyendo casi el 60-70% de la población total de neuronas en el cerebro de roedores 1,14. El cerebelo ha sido ampliamente utilizado para dilucidar los mecanismos de proliferación celular, migración, formación de dendritas y desarrollo de sinapsis 6,9,10,11,15,16,17,18,19,20 <sup class=…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El trabajo fue apoyado por las subvenciones de los NIH R01NS098804 (A.E.W.), F31NS113394 (U.C.) y el Programa de Neurociencia de Verano (DG) de la Universidad de Duke.
Materials
| Betadine | Purdue Production | 67618-150-17 | |
| Cemented 10 µL needle | Hamilton | 1701SN (80008) | 33 gauge, 1.27 cm (0.5 in), 4 point style |
| Chicken anti-GFP | Millipore Sigma | AB16901 | Our lab uses this antibody at a 1:1000 concentration |
| Cotton-tip applicator | |||
| Donkey anti-chicken Cy2 | Jackson ImmunoResearch | 703-225-155 | Our lab uses this antibody at a 1:500 concentration |
| Ethanol (200 proof) | Koptec | V1016 | |
| Electroporator ECM 830 | BTX Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| Fast Green FCF | Sigma | F7252-5G | |
| FUGW plasmid | Addgene | 14883 | |
| Glass slides | VWR | 48311-703 | Superfrost plus |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Heating pad | Softheat | ||
| Hoescht 33342 fluorescent dye | Invitrogen | 62249 | |
| Imaris | Bitplane | ||
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Micro cover glass | VWR | 48382-138 | |
| Nail polish | Sally Hansen | Color 109 | |
| Normal goat serum | Gibco | 16210064 | |
| O.C.T. embedding compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Olympus MVX10 Dissecting Scope | Olympus | MVX10 | |
| P200 pipette reach tip | Fisherbrand | 02-707-138 | Used for needle spacer |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| PBS pH 7.4 (10x) | Gibco | 70011-044 | |
| Simple Neurite Tracer | FIJI | https://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer:_Basic_ Instructions |
|
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Surgical tools | RWD Life Science | Small scissors and tweezers | |
| Triton X-100 | Roche | 11332481001 | non-ionic detergent |
| Tweezertrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0489 | 5 mm, platinum plated tweezer-type electrodes |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | 10977-015 | |
| Vectashield mounting media | Vectashield | H1000 | |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 1469SB | |
| Zeiss 780 Upright Confocal | Zeiss | 780 |
References
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