Serebellar Granül Nöron Morfolojisi ve Sinaps Gelişimini Incelemek için In Vivo Postnatal Elektroporasyonun Kullanılması
Summary
Burada, fare beyinciğindeki granül nöronların sinaptogenezini, doğum sonrası beyin gelişiminin zaman boyunca, bu hücreler sinaptik yapılarını rafine ettiklerinde ve kendilerini genel beyin devresine entegre etmek için sinapslar oluşturduklarında görselleştirmek için bir yöntem açıklıyoruz.
Abstract
Nöronlar, diğer hücrelerle uygun bağlantılar kurmak için beyin gelişimi sırasında yapılarında ve işlevlerinde dinamik değişikliklere uğrarlar. Kemirgen beyinciği, zaman içinde tek bir hücre tipi olan serebellar granül nöronun (CGN) gelişimini ve morfogenezini izlemek için ideal bir sistemdir. Burada, gelişmekte olan fare serebellumundaki granül nöron progenitörlerinin in vivo elektroporasyonu, sonraki morfolojik analizler için hücreleri seyrek olarak etiketlemek için kullanılmıştır. Bu tekniğin etkinliği, CGN olgunlaşmasının kilit gelişimsel aşamalarını sergileme yeteneğinde, bu hücrelerin sinaptik girdilerinin çoğunu aldığı özel yapılar olan dendritik pençelerin oluşumuna özel olarak odaklanarak gösterilmiştir. Serebellar gelişim boyunca CGN sinaptik yapılarının anlık görüntülerini sağlamanın yanı sıra, bu teknik, ilgilenilen herhangi bir genin rolünü ve CGN morfolojisi, pençe gelişimi ve sinaptogenezi üzerindeki etkisini incelemek için granül nöronlarını hücre özerk bir şekilde genetik olarak manipüle etmek için uyarlanabilir.
Introduction
Beyin gelişimi, embriyogenezden doğum sonrası yaşama kadar uzanan uzun bir süreçtir. Bu süre zarfında beyin, sonuçta davranışı yönlendirmek için dendritler ve aksonlar arasındaki sinapsların kablolamasını şekillendiren içsel ve dışsal uyaranların bir kombinasyonunu bütünleştirir. Kemirgen beyinciği, sinapsların nasıl geliştiğini incelemek için ideal bir model sistemidir, çünkü tek bir nöron tipi olan serebellar granül nöronun (CGN) gelişimi, bir progenitör hücreden olgun bir nörona geçerken izlenebilir. Bu, kısmen, serebellar korteksin çoğunluğunun doğum sonrası gelişmesinden kaynaklanmaktadır, bu da doğumdan sonra kolay genetik manipülasyona ve hücre etiketlemesine izin verir1.
Memelilerde, CGN farklılaşması, embriyonik gelişimin sonunda, arka beyindeki proliferatif hücrelerin bir alt kümesinin, beyincikyüzeyinde ikincil bir germinal bölge oluşturmak için eşkenar dörtgen dudağın üzerinden göç etmesiyle başlar 2,3,4. Granül nöron progenitör (GSMH) kimliğine tamamen bağlı olmalarına rağmen, bu hücreler doğum sonrası 14. güne (P14) kadar dış granül tabakasının (EGL) dış kısmında çoğalmaya devam ederler. Bu tabakanın çoğalması, beyinciğin büyük ölçüde genişlemesine neden olur, çünkü bu hücreler sadece CGN5’e yol açar. Yenidoğan CGN’ler EGL’deki hücre döngüsünden çıktıktan sonra, iç granül tabakasına (IGL) doğru içe doğru göç ederler ve beyinciğin moleküler tabakasında çatallanacak ve hareket edecek bir akson bırakarak Purkinje hücrelerine sinaps yapan paralel lifler oluştururlar6. Bu liflerin moleküler tabaka içindeki konumu, hücre döngüsü çıkışının zamanlamasına bağlıdır.
Farklılaşan CGN’ler önce paralel liflerini moleküler tabakanın altına doğru bırakırken, daha sonra farklılaşan CGN’lerin aksonları ilk 7,8’de kümelenir. CGN hücre gövdeleri IGL’ye ulaştığında, dendritleri detaylandırmaya ve yakındaki inhibitör ve uyarıcı nöronlarla sinapslar oluşturmaya başlarlar. Bir CGN’nin olgun dendritik ağacı, dört ana süreçle kalıplaşmış bir mimari sergiler. CGN olgunlaşması boyunca, bu dendritlerin sonundaki yapılar, postsinaptik proteinlerle zenginleştirilmiş bir pençe oluşturur 9,10. Dendritik pençeler olarak adlandırılan bu özel yapılar, sinapsların çoğunu granül nöronlar üzerinde içerir ve hem pons’tan kaynaklanan yosunlu lif innervasyonlarından uyarıcı girdileri hem de lokal Golgi hücrelerinden inhibitör girdileri almak için önemlidir. Tamamen yapılandırıldıktan sonra, CGN’lerin sinaptik bağlantıları, bu hücrelerin pre-serebellar çekirdeklerden gelen girdileri, serebellar korteksten derin serebellar çekirdeklere yansıtan Purkinje hücrelerine aktarmasına izin verir.
GSMH’lerin doğum sonrası in vivo elektroporasyonu, viral enfeksiyon ve transgenik fare çizgilerinin üretilmesi gibi diğer etiketleme tabanlı yöntemlere göre avantajlıdır, çünkü istenen yapıların ekspresyonu hızlı bir zaman çizelgesinde elde edilebilir ve yöntem, hücre özerk etkilerini incelemede yararlı olan küçük bir hücre popülasyonunu hedefler. Bu yöntem, CGN’lerin morfolojik gelişimini incelemek için önceki çalışmalarda kullanılmıştır; Bununla birlikte, bu çalışmalar ya tek bir zaman noktasına ya da kısa bir zaman penceresine odaklanmıştır 9,10,11,12,13. Bu etiketleme yöntemi, doğum sonrası yaşamın ilk üç haftasında CGN farklılaşmasının tüm zaman seyri boyunca meydana gelen CGN morfolojisindeki değişiklikleri belgelemek için görüntü analizi ile eşleştirildi. Bu veriler, serebellar devrelerin yapımının altında yatan CGN dendrit gelişiminin dinamiklerini ortaya koymaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Serebellar granül nöronlar, memeli beynindeki en bol nöronlardır ve kemirgen beynindeki toplam nöron popülasyonunun neredeyse% 60-70’ini oluşturur 1,14. Beyincik, hücresel proliferasyon, göç, dendrit oluşumu ve sinaps gelişimi mekanizmalarını aydınlatmak için yaygın olarak kullanılmıştır 6,9,10,11,15,16,17,18,19,20 …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Çalışma, NIH hibeleri R01NS098804 (A.E.W.), F31NS113394 (U.C.) ve Duke Üniversitesi’nin Yaz Sinirbilim Programı (D.G.) tarafından desteklendi.
Materials
| Betadine | Purdue Production | 67618-150-17 | |
| Cemented 10 µL needle | Hamilton | 1701SN (80008) | 33 gauge, 1.27 cm (0.5 in), 4 point style |
| Chicken anti-GFP | Millipore Sigma | AB16901 | Our lab uses this antibody at a 1:1000 concentration |
| Cotton-tip applicator | |||
| Donkey anti-chicken Cy2 | Jackson ImmunoResearch | 703-225-155 | Our lab uses this antibody at a 1:500 concentration |
| Ethanol (200 proof) | Koptec | V1016 | |
| Electroporator ECM 830 | BTX Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| Fast Green FCF | Sigma | F7252-5G | |
| FUGW plasmid | Addgene | 14883 | |
| Glass slides | VWR | 48311-703 | Superfrost plus |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Heating pad | Softheat | ||
| Hoescht 33342 fluorescent dye | Invitrogen | 62249 | |
| Imaris | Bitplane | ||
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Micro cover glass | VWR | 48382-138 | |
| Nail polish | Sally Hansen | Color 109 | |
| Normal goat serum | Gibco | 16210064 | |
| O.C.T. embedding compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Olympus MVX10 Dissecting Scope | Olympus | MVX10 | |
| P200 pipette reach tip | Fisherbrand | 02-707-138 | Used for needle spacer |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| PBS pH 7.4 (10x) | Gibco | 70011-044 | |
| Simple Neurite Tracer | FIJI | https://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer:_Basic_ Instructions |
|
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Surgical tools | RWD Life Science | Small scissors and tweezers | |
| Triton X-100 | Roche | 11332481001 | non-ionic detergent |
| Tweezertrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0489 | 5 mm, platinum plated tweezer-type electrodes |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | 10977-015 | |
| Vectashield mounting media | Vectashield | H1000 | |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 1469SB | |
| Zeiss 780 Upright Confocal | Zeiss | 780 |
References
- Altman, J., Bayer, S. A. . Development of the cerebellar system : in relation to its evolution, structure, and functions. , (1997).
- Rahimi-Balaei, M., Bergen, H., Kong, J., Marzban, H. Neuronal migration during development of the cerebellum. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 484 (2018).
- Alder, J., Cho, N. K., Hatten, M. E. Embryonic precursor cells from the rhombic lip are specified to a cerebellar granule neuron identity. Neuron. 17 (3), 389-399 (1996).
- Hatten, M. E., Heintz, N. Mechanisms of neural patterning and specification in the developing cerebellum. Annual Review of Neuroscience. 18, 385-408 (1995).
- Ben-Arie, N., et al. Math1 is essential for genesis of cerebellar granule neurons. Nature. 390 (6656), 169-172 (1997).
- Borghesani, P. R., et al. BDNF stimulates migration of cerebellar granule cells. Development. 129 (6), 1435-1442 (2002).
- Espinosa, J. S., Luo, L. Timing neurogenesis and differentiation: insights from quantitative clonal analyses of cerebellar granule cells. Journal of Neuroscience. 28 (10), 2301-2312 (2008).
- Markwalter, K. H., Yang, Y., Holy, T. E., Bonni, A. Sensorimotor coding of vermal granule neurons in the developing mammalian cerebellum. Journal of Neuroscience. 39 (34), 6626-6643 (2019).
- Shalizi, A., et al. PIASx is a MEF2 SUMO E3 ligase that promotes postsynaptic dendritic morphogenesis. Journal of Neuroscience. 27 (37), 10037-10046 (2007).
- Shalizi, A., et al. A Calcium-regulated MEF2 sumoylation switch controls poststynaptic differentiation. Science. 311 (5763), 1012-1017 (2006).
- Konishi, Y., Stegmuller, J., Matsuda, T., Bonni, S., Bonni, A. Cdh1-APC controls axonal growth and patterning in the mammalian brain. Science. 303 (5660), 1026-1030 (2004).
- Holubowska, A., Mukherjee, C., Vadhvani, M., Stegmuller, J. Genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (85), e51070 (2014).
- Yang, Y., et al. Chromatin remodeling inactivates activity genes and regulates neural coding. Science. 353 (6296), 300-305 (2016).
- Herculano-Houzel, S. Coordinated scaling of cortical and cerebellar numbers of neurons. Frontiers in Neuroanatomy. 4, 12 (2010).
- Wilson, P. M., Fryer, R. H., Fang, Y., Hatten, M. E. Astn2, a novel member of the astrotactin gene family, regulates the trafficking of ASTN1 during glial-guided neuronal migration. Journal of Neuroscience. 30 (25), 8529-8540 (2010).
- Kokubo, M., et al. BDNF-mediated cerebellar granule cell development is impaired in mice null for CaMKK2 or CaMKIV. Journal of Neuroscience. 29 (28), 8901-8913 (2009).
- Schwartz, P. M., Borghesani, P. R., Levy, R. L., Pomeroy, S. L., Segal, R. A. Abnormal cerebellar development and foliation in BDNF-/- mice reveals a role for neurotrophins in CNS patterning. Neuron. 19 (2), 269-281 (1997).
- Segal, R. A., Pomeroy, S. L., Stiles, C. D. Axonal growth and fasciculation linked to differential expression of BDNF and NT3 receptors in developing cerebellar granule cells. Journal of Neuroscience. 15 (7), 4970-4981 (1995).
- Zhou, P., et al. Polarized signaling endosomes coordinate BDNF-induced chemotaxis of cerebellar precursors. Neuron. 55 (1), 53-68 (2007).
- Dhar, M., Hantman, A. W., Nishiyama, H. Developmental pattern and structural factors of dendritic survival in cerebellar granule cells in vivo. Scientific Reports. 8 (1), 17561 (2018).
- Ito, M. Synaptic plasticity in the cerebellar cortex and its role in motor learning. Canadian Journal of Neurological Sciences. 20, 70-74 (1993).
- Jorntell, H., Hansel, C. Synaptic memories upside down: bidirectional plasticity at cerebellar parallel fiber-Purkinje cell synapses. Neuron. 52 (2), 227-238 (2006).
- Nakanishi, S. Genetic manipulation study of information processing in the cerebellum. Neurosciences. 162 (3), 723-731 (2009).
- Chang, C. H., et al. Atoh1 controls primary cilia formation to allow for SHH-triggered granule neuron progenitor proliferation. Developmental Cell. 48 (2), 184-199 (2019).
