Encellet karakterisering av kalsiumtilstrømning og HIV-1-infeksjon ved hjelp av en multiparameter optofluidisk plattform
Summary
Her presenterer vi en protokoll der enkeltceller overvåkes for akutte hendelser og produktiv HIV-1-infeksjon på en nanofluidisk enhet. Bildedata definerer interaksjoner mellom virusvertsreseptorer og signalveidynamikk. Dette er den første metoden for nanofluidisk høygjennomstrømning langsgående encellet kultur og avbildning for å studere signalkinetikk og molekylære interaksjoner.
Abstract
HIV-1 forårsaker en kronisk infeksjon som rammer mer enn 37 millioner mennesker over hele verden. Personer som lever med humant immunsviktvirus (HIV) opplever komorbiditet relatert til kronisk betennelse til tross for antiretroviral behandling. Imidlertid har disse inflammatoriske signalene ikke blitt fullstendig karakterisert. Rollen til tidlige inngangshendelser om aktivering av cellulære signalhendelser og nedstrøms genuttrykk er ikke fanget opp på encellet nivå. Her beskriver forfatterne en metode som anvender prinsipper for levende celle fluorescensmikroskopi til en automatisert encellet plattform som kulturer og bildeceller over brukertilpassede tidskurs, noe som muliggjør høy gjennomstrømningsanalyse av dynamiske cellulære prosesser. Denne analysen kan spore encellet levende fluorescensmikroskopi av tidlige hendelser som umiddelbart følger HIV-1-infeksjon, spesielt tilstrømningen av kalsium som følger med eksponering for viruset og utvikling av produktiv infeksjon ved hjelp av et fluorescerende reportervirus. MT-4 celler er lastet med kalsiumfølsomt fargestoff og dyrket i isolerte penner på en nanofluidisk enhet. De kultiverte cellene er infisert med et HIV-1-reportervirus (HIV-1 NLCI). Et fluorescensmikroskop plassert over nanofluidisk enhet måler kalsiumtilstrømning over et 8-minutters tidsforløp etter akutt HIV-1-eksponering. HIV-1 produktiv infeksjon måles i de samme cellene over et 4-dagers intervall. Bildedata fra disse tidskursene analyseres for å definere interaksjoner mellom virusvertsreseptorer og signalveidynamikk. Forfatterne presenterer et integrert, skalerbart alternativ til tradisjonelle bildemetoder ved hjelp av en ny optofluidisk plattform som er i stand til encellet sortering, kulturing, avbildning og programvareautomatisering. Denne analysen kan måle kinetikken til hendelser under ulike forhold, inkludert celletype, agonist eller antagonistisk effekt, mens du måler en rekke parametere. Dette er den første etablerte metoden for nanofluidisk høygjennomstrømning langsgående encellet kultur og avbildning: Denne teknikken kan tilpasses bredt for å studere cellulær signaleringskinetikk og dynamiske molekylære interaksjoner.
Introduction
Kronisk betennelse er en ledende årsak til HIV-assosierte tidlige sykeligheter ogdødelighet 1,2,3. Det finnes flere mekanismer der HIV kan aktivere inflammatorisk signalering, og nyere bevis tyder på en rolle for P2X-reseptorene i HIV-oppføring som er kalsium-gating adenosin triphosfat (ATP)reseptorer 3,4,5,6,7,8,9,10. P2X-undertypen av purinergiske reseptorer (P2XR) kan være viktige tilretteleggere for denne betennelsen. Imidlertid er de molekylære mekanismene for HIV-P2XR-interaksjoner i stor grad ukjente og kan påvirke tidlige og sene HIV-1 virale livssyklustrinn. Å definere veier og kinetikk som driver HIV-assosiert kronisk betennelse er avgjørende for å fremme behandlingstilbud for personer med HIV.
For å vurdere om HIV-1 direkte plager P2X-reseptorer, må P2XR-aktivering og HIV-1-infeksjon måles parallelt. Analyser av P2XR-aktivitet og HIV-1-infeksjon er uavhengig etablert: Cellulær kalsiumtilstrømning er en indikator på P2XR-aktivering, og HIV-1 produktiv infeksjon kan kvantifiseres av RNA-overflod. Fluorescensdeteksjon av kalsiumtilstrømning er mulig med Fluo-4 kalsiumsensitiv fargestoff, og HIV-1-infeksjon kan visualiseres med mCherry fluorescerende reportervirus HIV-NLCI11,12,13,14,15.
Fordi disse indikatorene for P2X-aktivering (akutt cellulær kalsiumtilstrømning) og HIV-1-infeksjon (HIV-1 RNA-syntese) forekommer på forskjellige tidsskalaer (minutter kontra dager), mangler det en høy gjennomstrømningsmetode som muliggjør sammenkoblet analyse av P2XR-aktivering og HIV-1-infeksjon. Standard eksperimentelle teknikker med høy gjennomstrømning, for eksempel strømningscytometri, tillater populasjonsanalysen, men kan ikke vurdere forholdet mellom akutte og langsgående hendelser i enkeltceller. Alternativt er encellet avbildning med standard fluorescensmikroskopi lav gjennomstrømning. Disse eksperimentelle begrensningene gir et behov for nye teknikker med høy gjennomstrømning for å måle assosiasjoner mellom akutte og langsgående cellulære hendelser direkte.
Et optofluidisk system som beskrives er en ny plattform som kan sortere og isolere enkeltceller, kultivering, bildebehandling og programvareautomatisering16,17,18,19. Dette systemet presenterer et integrert, høygjennomstrømningsalternativ til begrensningene ved tradisjonelle avbildningsmetoder. Beacon-plattformen består av et karbondioksid (CO2) og temperaturkontrollert inkubator som støtter celler som finnes på en brikke. Brikken har lysfølsomme transistorer som genererer en elektrisk gradient som svar på målrettet lys. Denne resulterende dielektrophoretiske kraften brukes til å flytte individuelle celler over nanofluidisk chip til de ønskede områdene. Celler sorteres i penner på brikken, noe som gir en barriere for å isolere individuelle celler fysisk. Kontinuerlig laminær strøm av vekstmedier gjennom hele brikken forhindrer cellemigrering fra pennene samtidig som det muliggjør småpartikkeldiffusjon av næringsstoffer og eksperimentspesifikke reagenser. Et fluorescensmikroskop sitter over brikken. Programvareautomatisering brukes til å ta bilder av brikken på det brukerangitte tidspunktet.
All cellekarakterisering ble utført ved hjelp av et optofluidisk system for enkeltcellet utvalg og manipulering. Dette systemet består av integrerte mekaniske, mikrofluidiske og optiske komponenter som muliggjør encellet manipulering, analyse, kultur og avbildning. Celler lastes og dyrkes på den engangs nanofluidiske enheten som består av 3500 individuelle kamre (penner), som hver er i stand til å holde sub-nanolitervolum. Celler kan plasseres i penner ved hjelp av lysinduserte dielektrophoretiske “bur” og dyrkes under temperatur- og CO2-kontrollerteforhold. Mikrofluidene tillater perfusjon av medier eller buffere på brikken for cellekultur eller narkotikabehandling. En aktivert nål gjør det mulig å importere og eksportere celler fra inkuberte og lukkede brønnplater. Sponområdet kan avbildes ved 4x eller 10x forstørrelse i brightfield og fluorescerende kanaler (inkludert DAPI, FITC, TRed eller Cy5) for å karakterisere cellulære fenotyper eller funksjonell analyse. Hele systemet automatiseres ved hjelp av programvare som kan brukes til forhåndsutformede arbeidsflyter eller egendefinerte eksperimenter.
Sammenhenger mellom HIV-1-infeksjon og P2XR er studert, men det er ikke rapportert en høy gjennomstrømningsprosedyre for å direkte karakterisere disse interaksjonene parallelt. Her beskriver forfatterne en metodikk for å studere HIV-P2XR-interaksjoner gjennom sporing av akutt kalsiumtilstrømning og påfølgende HIV-1-produktiv infeksjon på encellet nivå. Spesielt etablerer dette et nytt verktøy som muliggjør direkte, høy gjennomstrømning, langsgående måling av flere mål i enkeltceller.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den beskrevne metodikken for å studere forholdet mellom kalsiumtilstrømning og HIV-1 produktiv infeksjon i enkeltceller kan tilpasses for å studere intracellulær kalsiumkinetikk som svar på andre agonister eller antagonister av interesse. Utarbeidelsen av celler for avbildning er enkel, minimalt tidkrevende, og reagenser er tilgjengelige i praktiske sett fra mye brukte produsenter. Fluo-4-basert kalsiummåling er godt beskrevet i litteraturen, og HIV-1 kan lett erstattes med andre virus eller forbindelser av interes…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er takknemlige for de vitenskapelige diskusjonene med Dr. Benjamin Chen. Dette arbeidet ble finansiert av K08AI120806 (THS), R01DA052255 (THS og KB) og R21AI152833 (THS og KB).
Materials
| Beacon Optofluidic System | Berkeley Lights | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | ||
| FIJI | Open-source software | PMID: 22743772, 22930834 | |
| Fluo-4 Calcium Imaging Kit | Thermo Fisher | F10489 | |
| HIV-1 NLCINL4-3 | Laboratory of Benjamin Chen | PMID: 28148796 | |
| Hyclone Pennecillin Streptomycin solution | GE Healthcare Life sciences | SV30010 | |
| MT-4 cells | NIH AIDS Reagent | ARP-120 | |
| OptoSelect 3500 chip | Berkeley Lights | ||
| Pipettor Tips | Denville Scientific | P3020-CPS | |
| Prism 9.0.0 | GraphPad | ||
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Serological Pipettes | Fisher Brand | 13-678-11E | |
| Tissue Culture Hood | Various models | ||
| T75 flasks | Corning | 3073 | |
References
- Aberg, J. A. Aging, inflammation, and HIV infection. Topics in Antiviral Medicine. 20 (3), 101-105 (2012).
- Deeks, S. G., Tracy, R., Douek, D. C. Systemic effects of inflammation on health during chronic HIV infection. Immunity. 39 (4), 633-645 (2013).
- Swartz, T. H., Dubyak, G. R., Chen, B. K. Purinergic receptors: Key mediators of HIV-1 infection and inflammation. Fromtiers in Immunology. 6, 585 (2015).
- Giroud, C., Marin, M., Hammonds, J., Spearman, P., Melikyan, G. B. P2X1 receptor antagonists inhibit HIV-1 fusion by blocking virus-coreceptor interactions. Journal of Virology. 89 (18), 9368-9382 (2015).
- Hazleton, J. E., Berman, J. W., Eugenin, E. A. Purinergic receptors are required for HIV-1 infection of primary human macrophages. Journal of Immunology. 188 (9), 4488-4495 (2012).
- Marin, M., et al. High-throughput HIV-cell fusion assay for discovery of virus entry inhibitors. Assay and Drug Development Technology. 13 (3), 155-166 (2015).
- Soare, A. Y., et al. P2X Antagonists inhibit HIV-1 productive infection and inflammatory cytokines interleukin-10 (IL-10) and IL-1β in a human tonsil explant model. Journal of Virology. 93 (1), 01186 (2019).
- Sorrell, M. E., Hauser, K. F. Ligand-gated purinergic receptors regulate HIV-1 Tat and morphine related neurotoxicity in primary mouse striatal neuron-glia co-cultures. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 9 (2), 233-244 (2014).
- Swartz, T. H., Esposito, A. M., Durham, N. D., Hartmann, B. M., Chen, B. K. P2X-selective purinergic antagonists are strong inhibitors of HIV-1 fusion during both cell-to-cell and cell-free infection. Journal of Virology. 88 (19), 11504-11515 (2014).
- Soare, A. Y., et al. P2RX7 at the host-pathogen interface of infectious diseases. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 85 (1), (2021).
- Chen, P., Hübner, W., Spinelli, M. A., Chen, B. K. Predominant mode of human immunodeficiency virus transfer between T cells is mediated by sustained Env-dependent neutralization-resistant virological synapses. Journal of Virology. 81 (22), 12582-12595 (2007).
- Dale, B. M., et al. Cell-to-cell transfer of HIV-1 via virological synapses leads to endosomal virion maturation that activates viral membrane fusion. Cell Host Microbe. 10 (6), 551-562 (2011).
- Gee, K. R., et al. Chemical and physiological characterization of fluo-4 Ca(2+)-indicator dyes. Cell Calcium. 27 (2), 97-106 (2000).
- He, M. L., Zemkova, H., Koshimizu, T. A., Tomić, M., Stojilkovic, S. S. Intracellular calcium measurements as a method in studies on activity of purinergic P2X receptor channels. American Journal of Physiology and Cell Physiology. 285 (2), 467-479 (2003).
- Li, H., Zony, C., Chen, P., Chen, B. K. Reduced potency and incomplete neutralization of broadly neutralizing antibodies against cell-to-cell transmission of HIV-1 with transmitted founder envs. Journal of Virology. 91 (9), 02425 (2017).
- Beaumont, K. G., et al. Multiparameter cell characterization using nanofluidic technology facilitates real-time phenotypic and genotypic elucidation of intratumor heterogeneity. bioRxiv. , 457010 (2018).
- Le, K., et al. Assuring clonality on the beacon digital cell line development platform. Biotechnology Journal. 15 (1), 1900247 (2020).
- Mocciaro, A., et al. Light-activated cell identification and sorting (LACIS) for selection of edited clones on a nanofluidic device. Communications in Biology. 1, 41 (2018).
- Winters, A., et al. Rapid single B cell antibody discovery using nanopens and structured light. MAbs. 11 (6), 1025-1035 (2019).
- Wu, N., Nishioka, W. K., Derecki, N. C., Maher, M. P. High-throughput-compatible assays using a genetically-encoded calcium indicator. Science Reports. 9 (1), 12692 (2019).
- Esposito, A. M., et al. A high-throughput cre-lox activated viral membrane fusion assay to identify inhibitors of HIV-1 viral membrane fusion. Journal of Visualized Experiments. (138), e58074 (2018).
- Soare, A. Y., et al. P2X1 selective antagonists block HIV-1 infection through inhibition of envelope conformation-dependent fusion. Journal of Virology. 94 (6), 01622 (2020).
