Caratterizzazione a una cellula dell'afflusso di calcio e dell'infezione da HIV-1 utilizzando una piattaforma optofluidica multiparametro
Summary
Qui, presentiamo un protocollo in cui le singole cellule vengono monitorate per eventi acuti e infezioni produttive da HIV-1 su un dispositivo nanofluidico. I dati di imaging definiscono le interazioni del recettore virus-host e la dinamica del percorso di segnalazione. Questo è il primo metodo per la coltura e l’imaging longitudinali a singola cellula ad alta produttività nanofluidica per studiare la cinetica segnalante e le interazioni molecolari.
Abstract
L’HIV-1 causa un’infezione cronica che colpisce più di 37 milioni di persone in tutto il mondo. Le persone che vivono con il virus dell’immunodeficienza umana (HIV) sperimentano comorbilità correlata all’infiammazione cronica nonostante la terapia antiretrovirale. Tuttavia, questi segnali infiammatori non sono stati completamente caratterizzati. Il ruolo degli eventi di ingresso precoce sull’attivazione degli eventi di segnalazione cellulare e sull’espressione genica a valle non è stato catturato a livello di singola cellula. Qui gli autori descrivono un metodo che applica i principi della microscopia a fluorescenza a cellule vive a una piattaforma automatizzata a cella singola che colture e immagini le cellule rispetto ai corsi di tempo personalizzati dall’utente, consentendo l’analisi ad alta produttività dei processi cellulari dinamici. Questo saggio può tracciare la microscopia a fluorescenza viva a singola cellula dei primi eventi che seguono immediatamente l’infezione da HIV-1, in particolare l’afflusso di calcio che accompagna l’esposizione al virus e lo sviluppo di infezioni produttive utilizzando un virus reporter fluorescente. Le cellule MT-4 sono caricate con un colorante sensibile al calcio e coltivate in penne isolate su un dispositivo nanofluidico. Le cellule coltivate sono infettate da un virus reporter HIV-1 (HIV-1 NLCI). Un microscopio a fluorescenza posizionato sopra il dispositivo nanofluidico misura l’afflusso di calcio su un decorso di 8 minuti dopo l’esposizione acuta all’HIV-1. L’infezione produttiva dell’HIV-1 viene misurata in quelle stesse cellule per un intervallo di 4 giorni. I dati di imaging di questi corsi di tempo vengono analizzati per definire le interazioni del recettore virus-host e la dinamica del percorso di segnalazione. Gli autori presentano un’alternativa integrata e scalabile ai metodi di imaging tradizionali utilizzando una nuova piattaforma optofluidica in grado di smistamento, 1500, imaging e automazione del software a cella singola. Questo saggio può misurare la cinetica degli eventi in varie condizioni, tra cui il tipo di cellula, l’agonista o l’effetto antagonista, misurando al contempo una serie di parametri. Questo è il primo metodo stabilito per la coltura e l’imaging longitudinali a singola cellula ad alta produttività nanofluidica: questa tecnica può essere ampiamente adattata per studiare la cinetica di segnalazione cellulare e le interazioni molecolari dinamiche.
Introduction
L’infiammazione cronica è una delle principali cause di morbilità precoce associata all’HIV emortalità 1,2,3. Esistono diversi meccanismi in base ai quali l’HIV può attivare la segnalazione infiammatoria, e recenti prove suggeriscono un ruolo per i recettori P2X nell’ingresso dell’HIV che sono recettori del trifosfato di adenosina (ATP) che gatingcalcio 3,4,5,6,7,8,9,10. Il sottotipo P2X dei recettori purinergici (P2XR) può essere importante facilitatore di questa infiammazione. Tuttavia, i meccanismi molecolari delle interazioni HIV-P2XR sono in gran parte sconosciuti e possono avere un impatto sulle fasi del ciclo di vita virale dell’HIV-1 precoce e tardivo. Definire i percorsi e la cinetica che guidano l’infiammazione cronica associata all’HIV è fondamentale per far avanzare le opzioni di trattamento per le persone con HIV.
Per valutare se l’HIV-1 agonizza direttamente i recettori P2X, l’attivazione P2XR e l’infezione da HIV-1 devono essere misurate in parallelo. I test sull’attività P2XR e sull’infezione da HIV-1 sono stati stabiliti in modo indipendente: l’afflusso di calcio cellulare è un indicatore dell’attivazione P2XR e l’infezione produttiva dell’HIV-1 può essere quantificata dall’abbondanza di RNA. Il rilevamento della fluorescenza dell’afflusso di calcio è possibile con il colorante sensibile al calcio Fluo-4 e l’infezione da HIV-1 può essere visualizzato con il virus reporter fluorescente mCherry HIV-NLCI11,12,13,14,15.
Poiché questi indicatori di attivazione P2X (afflusso acuto di calcio cellulare) e infezione da HIV-1 (sintesi dell’RNA HIV-1) si verificano su scale temporali diverse (minuti contro giorni), manca un metodo ad alta produttività che consenta un’analisi accoppiata dell’attivazione P2XR e dell’infezione da HIV-1. Le tecniche sperimentali standard ad alta produttività, come la citometria del flusso, consentono l’analisi della popolazione ma non possono valutare la relazione tra eventi acuti e longitudinali in singole cellule. In alternativa, l’imaging a cella singola con microscopia a fluorescenza standard è a bassa produttività. Questi limiti sperimentali presentano la necessità di nuove tecniche ad alta produttività per misurare direttamente le associazioni tra eventi cellulari acuti e longitudinali.
Un sistema optofluidico descritto è una nuova piattaforma in grado di smistamento e isolamento a cella singola, 15, imaging e automazione software16,17,18,19. Questo sistema presenta un’alternativa integrata ad alta produttività ai limiti dei metodi di imaging tradizionali. La piattaforma Beacon è costituita da un’anidride carbonica (CO2)e un incubatore a temperatura controllata che supporta le cellule contenute in un chip. Il chip possiede transistor fotosensibili che generano un gradiente elettrico in risposta alla luce mirata. Questa forza dielettroforetica risultante è usata per spostare singole cellule attraverso il chip nanofluidico nelle regioni desiderate. Le cellule sono ordinate in penne sul chip, che forniscono una barriera per isolare fisicamente le singole cellule. Il flusso laminare continuo dei mezzi di crescita in tutto il chip impedisce la migrazione cellulare dalle penne, consentendo al contempo la diffusione di piccole particelle di nutrienti e reagenti specifici dell’esperimento. Un microscopio a fluorescenza si trova sopra il chip. L’automazione del software viene utilizzata per acquisire immagini del chip nel punto di tempo specificato dall’utente.
Tutta la caratterizzazione delle celle è stata eseguita utilizzando un sistema optofluidico per la selezione e la manipolazione a cella singola. Questo sistema è costituito da componenti meccanici, microfluidici e ottici integrati che consentono la manipolazione, il dosaggio, la coltura e l’imaging a cella singola. Le cellule vengono caricate e coltivate sul dispositivo nanofluidico usa e getta costituito da 3.500 camere singole (penne), ognuna in grado di contenere volume sub-nanoliter. Le cellule possono essere posizionate all’interno di penne utilizzando “gabbie” dielettroforetiche indotte dalla luce e coltivate in condizioni controllate da temperatura e CO2. Le microfluidica consentono la perfusione di supporti o tamponi sul chip per la coltura cellulare o il trattamento farmacologico. Un ago azionato consente l’importazione e l’esportazione di cellule da piastre di pozzo incubate e tappate. L’area del chip può essere immagine con ingrandimento 4x o 10x in canali fluorescenti e a campo luminoso (inclusi DAPI, FITC, TRed o Cy5) per caratterizzare fenotipi cellulari o analisi funzionali. L’intero sistema è automatizzato utilizzando software che può essere utilizzato per flussi di lavoro predesignati o esperimenti personalizzati.
Sono state studiate le relazioni tra l’infezione da HIV-1 e la P2XR, ma non è stata riportata una procedura ad alta produttività per caratterizzare direttamente queste interazioni in parallelo. Qui, gli autori descrivono una metodologia per studiare le interazioni HIV-P2XR attraverso il monitoraggio dell’afflusso acuto di calcio e della successiva infezione produttiva dell’HIV-1 a livello di singola cellula. In particolare, questo stabilisce un nuovo strumento che consente la misurazione longitudinale diretta, ad alta produttività e longitudinale di più bersagli in singole celle.
Protocol
Representative Results
Discussion
La metodologia descritta per studiare la relazione tra l’afflusso di calcio e l’infezione produttiva dell’HIV-1 in singole cellule può essere adattata per studiare la cinetica del calcio intracellulare in risposta ad altri agonisti o antagonisti di interesse. La preparazione delle celle per l’imaging è semplice, minimamente richiede molto tempo e i reagenti sono disponibili in comodi kit di produttori ampiamente utilizzati. La misurazione del calcio a base di Fluo-4 è ben descritta in letteratura e l’HIV-1 può essere…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo grati per le discussioni scientifiche con il dottor Benjamin Chen. Questo lavoro è stato finanziato da K08AI120806 (THS), R01DA052255 (THS e KB) e R21AI152833 (THS e KB).
Materials
| Beacon Optofluidic System | Berkeley Lights | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | ||
| FIJI | Open-source software | PMID: 22743772, 22930834 | |
| Fluo-4 Calcium Imaging Kit | Thermo Fisher | F10489 | |
| HIV-1 NLCINL4-3 | Laboratory of Benjamin Chen | PMID: 28148796 | |
| Hyclone Pennecillin Streptomycin solution | GE Healthcare Life sciences | SV30010 | |
| MT-4 cells | NIH AIDS Reagent | ARP-120 | |
| OptoSelect 3500 chip | Berkeley Lights | ||
| Pipettor Tips | Denville Scientific | P3020-CPS | |
| Prism 9.0.0 | GraphPad | ||
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Serological Pipettes | Fisher Brand | 13-678-11E | |
| Tissue Culture Hood | Various models | ||
| T75 flasks | Corning | 3073 | |
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