Encellig karakterisering av kalciumtillströmning och HIV-1-infektion med hjälp av en multiparameter optofluidisk plattform
Summary
Här presenterar vi ett protokoll där enstaka celler övervakas för akuta händelser och produktiv HIV-1-infektion på en nanofluidisk enhet. Bilddata definierar interaktioner mellan virusvärdreceptorer och signalvägsdynamik. Detta är den första metoden för nanofluidisk hög genomströmnings longitudinell encellig kultur och avbildning för att studera signaleringsk kinetik och molekylära interaktioner.
Abstract
HIV-1 orsakar en kronisk infektion som drabbar mer än 37 miljoner människor över hela världen. Personer som lever med humant immunbristvirus (HIV) upplever komorbiditet relaterad till kronisk inflammation trots antiretroviral behandling. Dessa inflammatoriska signalering har dock inte helt karakteriserats. Rollen av tidiga inträde händelser på aktivering av cellulära signalering händelser och nedströms gen uttryck har inte fångats på encellig nivå. Här beskriver författarna en metod som tillämpar principer för live-cell fluorescensmikroskopi till en automatiserad encellig plattform som kulturer och avbildar celler över användaranpassade tidskurser, vilket möjliggör analys av dynamiska cellulära processer med hög genomströmning. Denna analys kan spåra encellig levande fluorescensmikroskopi av tidiga händelser som omedelbart följer HIV-1-infektion, särskilt tillströmningen av kalcium som åtföljer exponering för viruset och utvecklingen av produktiv infektion med hjälp av ett fluorescerande reportervirus. MT-4-celler är laddade med ett kalciumkänsligt färgämne och odlas i isolerade pennor på en nanofluidisk enhet. De odlade cellerna är infekterade med ett HIV-1-reportervirus (HIV-1 NLCI). Ett fluorescensmikroskop placerat ovanför den nanofluidiska enheten mäter kalciumtillströmningen under en 8-minuters tidskurs efter akut HIV-1-exponering. HIV-1 produktiv infektion mäts i samma celler under ett 4-dagars intervall. Bilddata från dessa tidskurser analyseras för att definiera virus-värdreceptorinteraktioner och signalvägsdynamik. Författarna presenterar ett integrerat, skalbart alternativ till traditionella bildframställningsmetoder med hjälp av en ny optofluidisk plattform som kan sortera, odla, avbilda och automatisera programvara. Denna analys kan mäta kinetiken för händelser under olika förhållanden, inklusive celltyp, agonist eller antagonisteffekt, samtidigt som en rad parametrar mäts. Detta är den första etablerade metoden för nanofluidisk hög genomströmning längsgående encellig kultur och avbildning: Denna teknik kan i stort sett anpassas för att studera cellulära signalering kinetik och dynamiska molekylära interaktioner.
Introduction
Kronisk inflammation är en ledande orsak till HIV-associerade tidiga sjukligheter ochdödlighet 1,2,3. Det finns flera mekanismer där HIV kan aktivera inflammatorisk signalering, och nya bevis tyder på en roll för P2X-receptorerna i HIV-ingång som är kalcium-gating adenosin triphosphate (ATP) receptorer3,4,5,6,7,8,9,10. P2X subtyp av purinergic receptorer (P2XR) kan vara viktiga facilitatorer av denna inflammation. De molekylära mekanismerna i HIV-P2XR interaktioner är dock till stor del okända och kan påverka tidiga och sena HIV-1 virala livscykelsteg. Att definiera de vägar och kinetik som driver hiv-associerade kroniska inflammationer är avgörande för att främja behandlingsalternativ för personer med HIV.
För att bedöma om HIV-1 direkt våndas P2X-receptorer måste P2XR-aktivering och HIV-1-infektion mätas parallellt. Analyser av P2XR-aktivitet och HIV-1-infektion har oberoende fastställts: Cellulär kalciumtillströmning är en indikator på P2XR-aktivering, och HIV- 1-produktiv infektion kan kvantifieras av RNA överflöd. Fluorescensdetektering av kalciumtillströmning är möjlig med Fluo-4 kalciumkänsligt färgämne, och HIV-1-infektion kan visualiseras med mCherry fluorescerande reportervirus HIV-NLCI11,12,13,14,15.
Eftersom dessa indikatorer för P2X aktivering (akut cellulär kalcium tillströmning) och HIV-1 infektion (HIV-1 RNA syntes) förekommer på olika tidsskalor (minuter mot dagar), saknar det en hög genomströmningsmetod som möjliggör parisk analys av P2XR aktivering och HIV-1 infektion. Standard experimentella tekniker med hög genomströmning, såsom flödescytometri, möjliggör populationsanalysen men kan inte bedöma sambandet mellan akuta och longitudinella händelser i enstaka celler. Alternativt är encellig avbildning med standard fluorescensmikroskopi låg genomströmning. Dessa experimentella begränsningar utgör ett behov av nya, hög genomströmningstekniker för att mäta associationer mellan akuta och longitudinella cellulära händelser direkt.
Ett optofluidiskt system som beskrivs är en ny plattform som kan sortera och isolera en cell, odling, bildbehandling och programvaruautomation16,17,18,19. Detta system presenterar ett integrerat, hög genomströmningsalternativ till begränsningarna för traditionella avbildningsmetoder. Beacon-plattformen består av en koldioxid (CO2)och temperaturstyrd inkubator som stöder celler som finns på ett chip. Chipet har ljuskänsliga transistorer som genererar en elektrisk lutning som svar på riktat ljus. Denna resulterande dielektrofatiska kraft används för att flytta enskilda celler över det nanofluidiska chipet till önskade regioner. Celler sorteras i pennor på chipet, vilket ger en barriär för att isolera enskilda celler fysiskt. Kontinuerligt laminärt flöde av tillväxtmedier i hela chipet förhindrar cellmigration från pennorna samtidigt som det möjliggör småpartikeldiffusion av näringsämnen och experimentspecifika reagenser. Ett fluorescensmikroskop sitter ovanför chippet. Programvaruautomatisering används för att ta bilder av chipet vid den användarspecificerade tidpunkten.
All cell karakterisering utfördes med hjälp av ett optofluidic system för encellig markering och manipulering. Detta system består av integrerade mekaniska, mikrofluidiska och optiska komponenter som möjliggör encellig manipulering, analys, kultur och avbildning. Cellerna laddas och odlas på den nanofluidiska engångsanordningen som består av 3 500 enskilda kammare (pennor), som var och en kan hålla undernanolitervolym. Celler kan placeras i pennor med ljusinducerade dielektrofatiska “burar” och odlas under temperatur- och CO2-kontrolleradeförhållanden. Mikrofluidik tillåter perfusion av media eller buffertar på chipet för cellkultur eller läkemedelsbehandling. En aktiverad nål möjliggör import och export av celler från inkuberade och stängda brunnsplattor. Chipområdet kan avbildas vid 4x eller 10x förstoring i brightfield och fluorescerande kanaler (inklusive DAPI, FITC, TRed eller Cy5) för att karakterisera cellulära fenotyper eller funktionell analys. Hela systemet automatiseras med hjälp av programvara som kan användas för fördesignade arbetsflöden eller anpassade experiment.
Samband mellan HIV-1 infektion och P2XR har studerats, men en hög genomströmning förfarande för att direkt karakterisera dessa interaktioner parallellt har inte rapporterats. Här beskriver författarna en metodik för att studera HIV-P2XR interaktioner genom att spåra akut kalcium tillströmning och efterföljande HIV-1 produktiv infektion på encellsnivå. Detta etablerar särskilt ett nytt verktyg som möjliggör direkt, hög genomströmning, longitudinell mätning av flera mål i enstaka celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den beskrivna metoden för att studera sambandet mellan kalciumtillströmning och HIV- 1-produktiv infektion i enstaka celler kan anpassas för att studera intracellulär kalciumkinetik som svar på andra agonister eller antagonister av intresse. Beredningen av celler för avbildning är enkel, minimalt tidsintensiv, och reagenser finns i praktiska kit från allmänt använda tillverkare. Fluo-4-baserad kalciummätning är väl beskriven i litteraturen, och HIV-1 kan enkelt ersätta andra virus eller föreningar av intre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi är tacksamma för de vetenskapliga diskussionerna med dr Benjamin Chen. Detta arbete finansierades av K08AI120806 (THS), R01DA052255 (THS och KB) och R21AI152833 (THS och KB).
Materials
| Beacon Optofluidic System | Berkeley Lights | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | ||
| FIJI | Open-source software | PMID: 22743772, 22930834 | |
| Fluo-4 Calcium Imaging Kit | Thermo Fisher | F10489 | |
| HIV-1 NLCINL4-3 | Laboratory of Benjamin Chen | PMID: 28148796 | |
| Hyclone Pennecillin Streptomycin solution | GE Healthcare Life sciences | SV30010 | |
| MT-4 cells | NIH AIDS Reagent | ARP-120 | |
| OptoSelect 3500 chip | Berkeley Lights | ||
| Pipettor Tips | Denville Scientific | P3020-CPS | |
| Prism 9.0.0 | GraphPad | ||
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Serological Pipettes | Fisher Brand | 13-678-11E | |
| Tissue Culture Hood | Various models | ||
| T75 flasks | Corning | 3073 | |
References
- Aberg, J. A. Aging, inflammation, and HIV infection. Topics in Antiviral Medicine. 20 (3), 101-105 (2012).
- Deeks, S. G., Tracy, R., Douek, D. C. Systemic effects of inflammation on health during chronic HIV infection. Immunity. 39 (4), 633-645 (2013).
- Swartz, T. H., Dubyak, G. R., Chen, B. K. Purinergic receptors: Key mediators of HIV-1 infection and inflammation. Fromtiers in Immunology. 6, 585 (2015).
- Giroud, C., Marin, M., Hammonds, J., Spearman, P., Melikyan, G. B. P2X1 receptor antagonists inhibit HIV-1 fusion by blocking virus-coreceptor interactions. Journal of Virology. 89 (18), 9368-9382 (2015).
- Hazleton, J. E., Berman, J. W., Eugenin, E. A. Purinergic receptors are required for HIV-1 infection of primary human macrophages. Journal of Immunology. 188 (9), 4488-4495 (2012).
- Marin, M., et al. High-throughput HIV-cell fusion assay for discovery of virus entry inhibitors. Assay and Drug Development Technology. 13 (3), 155-166 (2015).
- Soare, A. Y., et al. P2X Antagonists inhibit HIV-1 productive infection and inflammatory cytokines interleukin-10 (IL-10) and IL-1β in a human tonsil explant model. Journal of Virology. 93 (1), 01186 (2019).
- Sorrell, M. E., Hauser, K. F. Ligand-gated purinergic receptors regulate HIV-1 Tat and morphine related neurotoxicity in primary mouse striatal neuron-glia co-cultures. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 9 (2), 233-244 (2014).
- Swartz, T. H., Esposito, A. M., Durham, N. D., Hartmann, B. M., Chen, B. K. P2X-selective purinergic antagonists are strong inhibitors of HIV-1 fusion during both cell-to-cell and cell-free infection. Journal of Virology. 88 (19), 11504-11515 (2014).
- Soare, A. Y., et al. P2RX7 at the host-pathogen interface of infectious diseases. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 85 (1), (2021).
- Chen, P., Hübner, W., Spinelli, M. A., Chen, B. K. Predominant mode of human immunodeficiency virus transfer between T cells is mediated by sustained Env-dependent neutralization-resistant virological synapses. Journal of Virology. 81 (22), 12582-12595 (2007).
- Dale, B. M., et al. Cell-to-cell transfer of HIV-1 via virological synapses leads to endosomal virion maturation that activates viral membrane fusion. Cell Host Microbe. 10 (6), 551-562 (2011).
- Gee, K. R., et al. Chemical and physiological characterization of fluo-4 Ca(2+)-indicator dyes. Cell Calcium. 27 (2), 97-106 (2000).
- He, M. L., Zemkova, H., Koshimizu, T. A., Tomić, M., Stojilkovic, S. S. Intracellular calcium measurements as a method in studies on activity of purinergic P2X receptor channels. American Journal of Physiology and Cell Physiology. 285 (2), 467-479 (2003).
- Li, H., Zony, C., Chen, P., Chen, B. K. Reduced potency and incomplete neutralization of broadly neutralizing antibodies against cell-to-cell transmission of HIV-1 with transmitted founder envs. Journal of Virology. 91 (9), 02425 (2017).
- Beaumont, K. G., et al. Multiparameter cell characterization using nanofluidic technology facilitates real-time phenotypic and genotypic elucidation of intratumor heterogeneity. bioRxiv. , 457010 (2018).
- Le, K., et al. Assuring clonality on the beacon digital cell line development platform. Biotechnology Journal. 15 (1), 1900247 (2020).
- Mocciaro, A., et al. Light-activated cell identification and sorting (LACIS) for selection of edited clones on a nanofluidic device. Communications in Biology. 1, 41 (2018).
- Winters, A., et al. Rapid single B cell antibody discovery using nanopens and structured light. MAbs. 11 (6), 1025-1035 (2019).
- Wu, N., Nishioka, W. K., Derecki, N. C., Maher, M. P. High-throughput-compatible assays using a genetically-encoded calcium indicator. Science Reports. 9 (1), 12692 (2019).
- Esposito, A. M., et al. A high-throughput cre-lox activated viral membrane fusion assay to identify inhibitors of HIV-1 viral membrane fusion. Journal of Visualized Experiments. (138), e58074 (2018).
- Soare, A. Y., et al. P2X1 selective antagonists block HIV-1 infection through inhibition of envelope conformation-dependent fusion. Journal of Virology. 94 (6), 01622 (2020).
