Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Retinal Pigment Epitel Transplantation i en ikke-human primat model for degenerative retinale sygdomme

Published: June 14, 2021 doi: 10.3791/62638
Automatic Translation
*1,2, *1,3,4, 1, 2, 1,2,5, 1,4,6, 1,2,4, 1,2,3,4, 1,7,8
1Department of Ophthalmology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 2Department of Ophthalmology, National University Hospital, Singapore, 3Institute of Molecular and Cell Biology (IMCB), Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), 4Singapore Eye Research Institute (SERI), 5UCL Institute of Ophthalmology, 6Academic Clinical Program in Ophthalmology, Duke-NUS Medical School, 7Macula Center Saar, Eye Clinic Sulzbach, Knappschaft Hospital Saar, 8Department of Ophthalmology, University of Bonn
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Den ikke-menneskelige primat (NHP) er en ideel model til at studere human retinal cellulær terapi på grund af de anatomiske og genetiske ligheder. Dette manuskript beskriver en metode til submakulær transplantation af retinale pigment epitelceller i NHP øje og strategier til at forhindre intraoperative komplikationer forbundet med makula manipulation.

Abstract

Retinal pigment epitel (RPE) transplantation holder store løfte til behandling af arvelige og erhvervede retinale degenerative sygdomme. Disse betingelser omfatter retinitis pigmentosa (RP) og avancerede former for aldersrelateret makuladegeneration (AMD), såsom geografisk atrofi (GA). Tilsammen udgør disse lidelser en betydelig del af den i øjeblikket uhelbredelige blindhed globalt. Disse uopfyldte medicinske behov har skabt øget akademisk interesse i at udvikle metoder til RPE udskiftning. Blandt de dyremodeller, der almindeligvis anvendes til præklinisk testning af terapi, er den ikke-menneskelige primat (NHP) den eneste dyremodel, der har en macula. Da det deler denne anatomiske lighed med det menneskelige øje, er NHP-øjet en vigtig og passende præklinisk dyremodel til udvikling af avancerede terapilægemidler (ATMPs) såsom RPE-celleterapi.

Dette manuskript beskriver en metode til submakulær transplantation af en RPE monolayer, kultiveret på en polyethylen terephthalat (PET) cellebærer, under macula på en kirurgisk skabt RPE sår i immunsupprimerede NHPs. Den fovea-den centrale avaskulære del af macula-er stedet for den største mekaniske svaghed under transplantationen. Foveal traumer vil opstå, hvis den første subretinale væske injektion genererer en overdreven kraft på nethinden. Derfor anbefales langsom injektion under perfluorcarbonvæske (PFCL) glasagtig tamponade med en dobbeltboret subretinal injektionsdeyle ved lave intraokulære trykindstillinger (IOP) for at skabe en retinal bleb.

Forbehandling med en intravitreal plasminogen injektion for at frigive parafoveal RPE-fotoreceptor vedhæsioner anbefales også. Disse kombinerede strategier kan reducere sandsynligheden for foveal tårer i forhold til konventionelle teknikker. NHP er en vigtig dyremodel i den prækliniske fase af RPE-celleterapiudvikling. Denne protokol løser de tekniske udfordringer, der er forbundet med levering af RPE cellulære terapi i NHP øjet.

Introduction

RPE transplantation holder store løfter til behandling af arvelige og erhvervede retinale degenerative sygdomme. Disse betingelser omfatter retinitis pigmentosa (RP, stang-kegle dystrofi) og avancerede former for AMD såsom GA. Kollektivt, disse lidelser udgør en betydelig andel af i øjeblikket uhelbredelig blindhed globalt1,2. De avancerede stadier af AMD er kategoriseret i neovaskulær AMD (nAMD) og GA. Mens der er effektive behandlingsmuligheder for nAMD, såsom anti-vaskulære endotel vækstfaktor (anti-VEGF) injektioner, patienter med GA har begrænsede behandlingsmuligheder. RP er en meget heterogen gruppe af arvelige retinale lidelser karakteriseret ved progressiv retinal fotoreceptor degeneration. Hos nogle patienter er den forårsagende genetiske defekt placeret i RPE snarere end fotoreceptorerne; Derfor kan RPE-substitutionsbehandling være en alternativ strategi, hvis genterapi ikke er mulig.

Der er betydelig interesse i at udvikle effektive behandlinger for disse betingelser. Især har RPE-transplantation fået trækkraft som en potentiel terapeutisk tilgang3,4,5,6,7,8. Siden de første rapporter om RPE-transplantation dukkede op i 1980'erne, er feltet udvidet til at omfatte forskellige RPE-cellekilder, leveringsstrategier og eksperimentelle modeller for sygdom og transplantation10,11,12,13,14. Blandt de forskellige dyremodeller har kun NHP en 'macula lutea' med en 'fovea centralis', en anatomisk specialisering på nethindens bageste pol, der deles med mennesker. Fovea indeholder en meget høj densitet af kegle fotoreceptorer muliggør høj opløsning central vision15. NHP har også en lignende genomisk og proteomisk make-up16 sammenlignet med mennesker. Disse ligheder gør det til en vigtig og passende dyremodel til undersøgelse af øjensygdomme, der påvirker den menneskelige nethinde17,18.

Dette manuskript beskriver en metode til submakulær transplantation af en RPE xenograft, støttet af en PET-cellebærer, i immunsupprimerede NHPs. En transvitreal teknik til subretinal RPE transplantation hos kaniner er blevet beskrevet i et tidligere manuskript19. Men i NHPs kræver tilstedeværelsen af fovea særlig omhu under intraoperativ manipulation20. Især er der en høj risiko for en foveal tåre, hvis subretinale væske injektion metoder generere en overdreven kraft på nethinden20. Fokus for dette manuskript er derfor på strategier til at reducere risikoen for utilsigtet foveal traumer i NHP.

Disse omfatter anvendelse af præoperativ intravitreal plasminogen injektion til frigivelse af parafoveale vedhæhæftninger og kirurgisk mikroskop-integreret optisk sammenhæng tomografi (miOCT) intraoperativt for real-time visualisering af foveal anatomi. En skræddersyet 25/41 G dobbeltboret subretinale kanyle med intraokulær PFCL tamponade under lave IOP-indstillinger foreslås for at muliggøre en mere kontrolleret proces med foveal løsrivelse. Desuden anbefales kirurgisk fjernelse af native RPE før implantation for at muliggøre bedre integration mellem de transplanterede RPE-celler og værtsfotoreceptorer. Endelig er en peri- og postoperativ systemisk immunsuppression protokol for NHP modeller beskrevet for at forbedre overlevelsen af RPE xenograft post-transplantation11,21.

Protocol

BEMÆRK: Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med The Association of Research in Vision and Oftalmology (ARVO) til brug af dyr i oftalmisk og visionsforskning. Etisk godkendelse blev opnået fra Institutional Animal Care and Use Committee, SingHealth, Singapore. Dyrene blev anbragt på SingHealth Experimental Medicine Centre godkendt af Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC). Denne godkendelse understreger, at alle dyreforsøg er i overensstemmelse med standarderne i den nationale rådgivende komité for laboratoriedyrforskningsretninger, der er fastsat af Agri-Food and Veterinary Authority of Singapore. Følgende eksperimentelle protokol blev etableret baseret på eksperimenter udført i 6 øjne på 6 Macaca fascicularis (4 mand og 2 kvinder, 4 til 6 år, 2,8 til 4,0 kg) .

1. Opnåelse af immunsuppression i NHP-modellen

  1. Start immunsuppressionen 7 dage før operationen og fortsæt immunsuppressionen i hele opfølgningsperioden.
  2. Afvej NHP før administration af systemisk immunsuppression for at sikre nøjagtig medicin dosering. Dyret vejes ved baseline og ugentligt derefter.
  3. Brug oral sirolimus, doxycyclin, og minocyclin at opnå systemisk immunsuppression.
    1. Giv en belastningsdosis på 2 mg oral sirolimus efterfulgt af en daglig vedligeholdelsesdosis på 1 mg. Opnå baseline blod sirolimus niveau før administration og overvåge dette i hele opfølgningsperioden. Sørg for en koncentration på mindst 5 μg/L for tilstrækkelig immunsuppression.
      BEMÆRK: Sirolimusdosis er ikke vægttilpasset.
    2. Giv en dosis på 7,5 mg/kg oral doxycyclin om dagen, to gange om dagen.
    3. Giv en dosis på 7,5 mg/kg oral minocyclin om dagen, to gange om dagen.
  4. Under immunsuppression, overvåge alle NHPs for negative systemiske virkninger. Kig efter betydelige vægttab (>10%), nedsat appetit og vandforbrug, ungroomed hårtab, og unormal adfærd såsom aggression og sløvhed. Vurderingerne vil blive foretaget på dag 3, 14 og 1 måned, efterfulgt af månedlige vurderinger.

2. Sterilisering af instrumentet

  1. Skyl de kirurgiske instrumenter ved hjælp af destilleret vand.
  2. Placer instrumenterne i et ultralydsbad fyldt med 500 mL destilleret vand og 2 mL instrumentdesinfektionsmiddel. Rengør instrumenterne ved hjælp af ultralydsbadets fejefunktion i 15 minutter.
  3. Fjern instrumenterne fra ultralydsbadet. Skyl to gange grundigt med destilleret vand i 5 min hver skylning. Lufttørre instrumenterne efter skylningen.
  4. Placer instrumenterne i en instrumentkasse. Autoklave boksen ved hjælp af den universelle programindstilling (sterilisering af instrumenter ved 134 °C i 50 min: 30 min til autoklavering, 20 min til tørring).

3. Fremstilling af konserveringsmiddelfri triamcinolone (40 mg/mL)

  1. Træk 1 mL triamcinolonopløsningen (10 mg/mL) tilbage med en 1 mL-sprøjte. Overfør det til et 15 mL konisk rør og bland det med 4 mL steril afbalanceret saltopløsning (BSS).
  2. Centrifuge opløsningen ved 120 × g i 5 min. Sørg for, at alle triamcinolonepartikler er i bunden af det koniske rør. Kassér supernatanten (BSS) fra det koniske rør.
  3. Ophæng triamcinolonepartiklerne igen med 5 mL steril BSS i det koniske rør. Centrifuge opløsningen ved 120 × g i 5 min. Kassér supernatanten igen.
  4. Gentag trin 3.3 for at fuldføre vask af triamcinolonepartiklerne med BSS (3x).
  5. Ophæng triamcinolonepartiklerne igen med 0,25 mL steril BSS for at opnå en koncentration på 40 mg/mL.
  6. Aspirere den genophængte triamcinolone (40 mg/mL) med en ny 1 mL sprøjte. Fastgør en 25 G stump spids fløjtenål, og hold sprøjten med triamcinoloneopløsningen klar til intraoperativ brug.

4. Forbehandling af NHP øjne med intravitreal plasminogen (0,25 μg/μL)

  1. En uge før operationen skal der gives en intravitreal injektion (20 μL) abeplasminogen (0,25 μg/μL).
  2. Se nhp før proceduren med en intramuskulær injektion af ketamin (10-20 mg/kg BW) og en subkutan injektion af atropin (0,05 mg/kg BW). Administrere tetracain øjendråber til lokalbedøvelse.
  3. Før intravitreal injektion desinficeres periorbitalområdet med 10% povidone-jod. Desinficer øjet ved at administrere 5% povidone-jod til nhp's konjunktivale utugt. Sørg for, at opløsningen forbliver i utugten i mindst 1 minut, før den skylles grundigt med steril BSS.
  4. Brug en 250 μL sprøjte til at aspirere den prædiluterede abe plasminogen (0,25 μg/μL) fra hætteglasset. Fastgør en 30 G nål til sprøjten, og hold aben plasminogen klar til intravitreal administration.
  5. Brug et par calipers til at identificere injektionsstedet på øjet. Giv intravitreal injektionen 3 mm væk fra limbus.
  6. Fortsæt med injektionen med nålen rettet mod midten af kloden. Ved fjernelse af nålen fra kloden skal du bruge en bomuldsapplikatorpind til at tæmme injektionsstedet og forhindre refluks af det intraokulære indhold.
  7. Giv en smøremiddelgel eller salve for at reducere øjeblikkelig postoperativ okulær overfladeirritation.

5. Opsætning af kirurgisk bord og udstyr

  1. Etablere et sterilt felt. Når du er i det sterile felt, bære kirurgiske scrubs, maske, og hårdække på alle tidspunkter.
  2. Den konserveringsmiddelfri triamcinolone (40 mg/mL) forberedes til intraoperativ visualisering af glaslegeme (se afsnit 3). Forbered den sterile BSS i en 10 mL sprøjte og smøremiddel i en 5 mL sprøjte. Læg dem på en drapering.
  3. Hold andre instrumenter klar på en drapering, herunder 3-0 silke, 7-0 vicryl suturer, bomuld applikator sticks, sår lukning strimler, og lysekrone endoillumination fibertråd.
  4. Tilslut vitrektomi sæt, herunder high-speed vinmåler, Venturi kassette, og 25 G lysekrone endoilluminator til vitrektomi maskine ved hjælp af steril teknik.
  5. Åbn en 500 mL oftalmisk kvalitet BSS flaske og tilslut den til Venturi kassette i overensstemmelse med producentens anvisninger. Fortsæt med at grunde systemet.
  6. Tænd miOCT/kirurgisk mikroskop. Vælg forudindstillede konfigurationer af det kirurgiske mikroskop til posterior segmentkirurgi og belysning. Indtast detaljerne i proceduren, herunder ID, køn, lateralitet af dyrets øje og navnet på proceduren.
  7. Monter en ikke-kontakt, vidvinkel, 128-graders fundus linse.
  8. Fastgør sterile engangshåndstykkedæksler på det kirurgiske mikroskop/miOCT. Juster mikroskopets position, og fokuser ved hjælp af fodpedalen. Fortsæt med operationen.

6. Fremstilling af anæstesi og positionering af dyret (helst udført af dyrlægeteam)

  1. Sørg for NHP er fastende i mindst 8 timer før induktion af anæstesi for at forhindre regurgitation og opkastning. Bedøve NHP før induktion af anæstesi (se trin 4.2 for sedation instruktioner).
  2. Påfør 1% tropicamid og 2,5% phenylephrine øjendråber mindst 3x med 5 min intervaller for at opnå pupiludvidelse.
  3. Giv en intramuskulær injektion af buprenorphin (0,005-0,03 mg/kg BW) 30 min før operationen for at opnå smertestillende midler.
  4. Intuberere NHP med en endobbepresse rør, normalt 3-5 mm i størrelse. Når du forsøger intubation, skal du sørge for, at flere størrelser er tilgængelige. Brug den største størrelse, der kan passeres gennem strubehovedet uden at forårsage traumer. Mål slutvandvands-CO2 for at sikre passende placering af endotrakealrør.
  5. Levere 2% isofluorane gas via endotracheal rør til at fremkalde generel anæstesi. Bekræft tilstanden af generel anæstesi (manglende reaktion på berøring) ved at vurdere NHP's reaktion på omgivende stimuli, herunder lyde og berøring. Brug 0,5-2% isofluoranegas til at opretholde tilstanden af generel anæstesi.
  6. Løbende overvåge NHP elektrokardiogram, åndedrætsfrekvens, blodtryk, og iltmætning under hele operationen.
  7. Placer NHP på det kirurgiske bord, således at øjet er vinkelret på det kirurgiske mikroskop. Giv en smøremiddelgel eller salve til øjet, som ikke betjenes for at reducere okulær overfladeirritation under anæstesi.
  8. Skær øjenvipperne ved hjælp af en saks for at reducere risikoen for infektioner.
  9. Desinficer periorbitalområdet med 10% povidone-jod. Desinficer øjet ved at administrere 5% povidone-jod til nhp's konjunktivale utugt. Sørg for, at opløsningen forbliver i utugten i mindst 1 minut, før den skylles grundigt med steril BSS.
  10. Placer en steril drapering sådan, at den pre-cut åbning er centreret over øjet for at gennemgå kirurgi. Dæk øjet med et klæbende kirurgisk snit drapere.
  11. Udfør en lateral canthothotomi på øjet for at gennemgå kirurgi.
  12. Indsæt Lieberman-speculum for at sikre tilstrækkelig åbning af øjenlågene til visualisering af øjet.

7. Vitrektomi

BEMÆRK: For at få adgang til det subretinale rum til levering af PET-stilladsen RPE-transplantat anbefaler denne protokol en 4-port (ventileret) 25 G vitrektomi, der skal udføres ved hjælp af et standard vitreoretinal kirurgisk setup og en ikke-kontakt, vidvinklet, 128 ° fundus linse. Protokollen anbefaler også brug af et kirurgisk mikroskop udstyret med miOCT til at guide flere kritiske kirurgiske trin, herunder induktion af foveal løsrivelse, implantation af RPE graft, og subretinalvæske dræning.

  1. Udfør en 360° konjunktival peritomy ved at incising bindehinden nær limbus ved hjælp af et par vannas saks. Forstør peritomy ved at udføre en stump dissektion.
  2. Brug en 25 G mikrovitreoretinal klinge, udføre en sclerotomi på 8 klokken for højre øje eller 4 klokken for venstre øje. Udfør sclerotomien 3 mm fra øjets limbus.
  3. Indsæt og sy en 25 G brugerdefineret side port-infusion kanyle ved hjælp af 7-0 vicryl sutur. Efter at have bekræftet intravitreal placering, skal du starte BSS infusionen og indstille systemet til at opretholde en IOP på 20 mmHg.
  4. Brug en 25 G flad hoved trochar, udføre en sclerotomi på 2 klokken for højre øje eller 10 klokken for venstre øje, som i trin 7,2.
  5. Sæt 25 G lysekrone lys ind i flathead trochar og fastgør det med klæbende tape. Juster lyskilden til ca. 60 %.
  6. Udfør en anden sclerotomi, svarende til trin 7.2, klokken 10 for højre øje eller klokken 2 for venstre øje. Placer U-formet vicryl 7-0 suturer omkring sclerotomi uden at binde knuderne. Sæt vitrektomiskæreren spids gennem denne sclerotomi.
  7. Start vitrektomien omkring indgangsportene efterfulgt af en kort kerne vitrektomi med følgende indstillinger: maksimalt 5000 snit i minuttet, maksimalt aspiration ved 400 mmHg.
  8. Indsprøjt 20-50 μL triamcinolone (40 mg/mL) for bedre glasagtig visualisering.
  9. Inducer en bageste glasagtig løsrivelse (PVD) ved at adskille glaslegemet fra nethinden.
    1. Placer vinmåleren over den optiske skive for at tillade skånsom induktion af PVD' en. Hold kun vinmåleren på aspiration ved den maksimale indstilling på 400 mmHg uden at skære involveret.
    2. Hvis det er nødvendigt, skal du bruge 25 G intraokulære sammentakkerne til at manipulere glaslegemet ved diskmargenen for at skabe en tåre i glaslegemet cortex for at lette løsrivelse.
      BEMÆRK: PVD anses for vellykket, hvis triamcinolon krystaller glider uhindret over nethinden overflade.
  10. Åbn den bageste hyaloidmembran med fræseren, og fjern den løsrevne glasagtige nederdel op til glaslegemet (ved nethinden ækvator). Aspirere eventuelle resterende triamcinolone på nethinden overflade.

8. miOCT-styret foveal løsrivelse

  1. Indsprøjt 1-2 mL PFCL til at dække den bageste stang op til den forreste, midt-perifere nethinden.
  2. Indtast øjet med en subretinal injektion kanyle. Indstil IOP til 0-4 mmHg på vitrektomimaskinen (sørg for perfekt vandtæt system; hvis det er nødvendigt, binde suturer rundt om portene).
  3. Ved hjælp af enten den 25/41 G tilpassede subretinale injektionsdeluge med dobbeltboring eller 25/38 G subretinal injektionskantel, der er tilsluttet en 250 μL-sprøjte, skal du forsigtigt udføre en subretinal injektion af BSS for at fremkalde en lokaliseret nethindeudsektion. Når bleb bare krydser fovea, stop injektionen. Opret en anden bleb fra en separat retning. Flet begge blebs til fuldt ud at løsne fovea.
  4. Aktiver miOCT-funktionen for at visualisere bleb-formation. Sørg for, at linje- og kubescanningerne er i HD-tilstand med indstillingerne (512 x 128 pixels, scanningsbredde 4 mm) for at få et billede på fovea. Overhold miOCT-billedet for en fuldstændig løsrivelse af neural nethinden fra RPE-laget ved fovea.
  5. Forstør retinotomien til 1,5 mm med et par lodrette 25 G vitreoretinal saks for at give adgang til det subretinale rum til transplantation.

9. Fjernelse af indfødte RPE

  1. Sæt IOP til 50 mmHg på vitrektomimaskinen.
  2. Fjern PFCL via aktiv ekstrudering ved hjælp af en børstet silikonespids kanyle.
  3. Sclerotomien udvides med en 1,4 mm snitkniv, så der kan komme et 20 G instrument ind.
  4. Skrab den submakulære værts RPE med en brugerdefineret 20 G-løkkeinstrument til fjernelse. Skrab et område, der måler mindst 2 x 3 mm.

10. Lastning af shooter til levering af RPE celle monolayer transplantation

  1. For generelle instruktioner om lastning af en kugleformet graft skåret fra RPE kulturer på PET cellebærere, henvises til en tidligere publikation22.

11. miOCT-styret graft implantation og positionsjustering

  1. Sæt spidsen af skydeenheden gennem sclerotomien ved en IOP på 20 mmHg. Indsprøjt implantatet mod subretinale rum via retinotomi kant skabt fra nethinden overflade.
  2. Indsprøjt implantatet med cellebærersiden mod Bruchs membran og RPE-xenograftsiden, der vender mod fotoreceptorerne.
  3. Aktiver miOCT-funktionen for at visualisere implantatplaceringen. Sørg for, at implantatet hviler fladt på Bruchs membran i det subretinale rum med en intakt overlying nethinde. Sørg for, at det er placeret en rimelig afstand fra den skabte retinotomi og ikke hindrer på retinotomi site.
  4. Juster implantatstillingen med subretinal injektionslugen eller en 25 G buet intraokulær saks for at sikre, at den er godt placeret under maculaen.

12. miOCT-styret dræning af subretinalvæske

  1. Brug en børstet silikonespids kanyle, udføre en væske-luft udveksling og omhyggelig subretinale væske dræning. Forsøg blid subretinalvæske aspiration fra bleb retinal løsrivelse og retinotomi kant apposition.
  2. Aktiver miOCT-funktionen til realtidsvisualisering af tilstrækkelig subretinalvæskeafløb, indtil nethinden er fastgjort igen over implantatet.

13. Afslutning af operationen

  1. Luk arbejdsportens sclerotomi ved hjælp af den forlagte 7-0 vicryl sutur. Fjern 25 G lysekrone og 25 G infusion kanyle. Luk disse sclerotomies med 7-0 vicryl suturer.
  2. 2 mg i 0,05 ml intravitreal konserveringsmiddel gratis triamcinolone (40 mg/ml) ved kl.
  3. Palpate øjet for at sikre, at IOP er inden for det acceptable interval. Indsprøjt filtreret luft (eller BSS) via en 30 G nål, hvis det er nødvendigt.
  4. Sy bindehinden med 7-0 vicryl suturer og canthothotomi med 5-0 prolene (fjern efter 10-14 dage).

14. Postoperativ dyrepleje

  1. Placer NHP med billedsiden nedad i 1 time efter operationen. Efterlad ikke dyret uden opsyn, før bevidstheden er genvundet. Sørg for, at en dyrlæge og dyreplejetekniker er til rådighed for observation og støtte under den postoperative proces.
  2. Påfør aktuelt antibiotikum (tobramycin), steroid (dexamethason) salve, og homatropin øjet falder to gange om dagen i 5 dage postoperativt.
  3. Giv en anden subkutan buprenorphin (0,005-0,03 mg/kg BW) injektion 6 timer efter operationen for tilstrækkelig smertekontrol.
  4. Returner NHP til selskab med andre dyr, når det er kommet helt tilbage bevidstheden.
  5. Udfør multimodale billedbehandling opfølgninger på dag 3, 14 og måned 1 efter proceduren, efterfulgt af månedlige helbredsundersøgelser. Udfør ERG'er hver måned efter proceduren. Fjern de 5-0 prolene suturer for canthotomy på dag 14 samtidig med sedation periode, der anvendes til multimodal billeddannelse. De resterende suturer er resorberbare, 7-0 vicryl suturer, som ikke kræver fjernelse.

15. Postoperative overvågningsmetoder for multimodal billeddannelse

  1. Hurtigt NHP natten over. Bedøve NHP lige før billeddannelse (se trin 4.2 for stof og koncentration for sedation). Hvis sedation er utilstrækkelig til at stoppe øjenbevægelser, overveje brugen af generel anæstesi.
  2. Påfør 1% tropicamid og 2,5% phenylephrine øjendråber for at opnå pupiludvidelse før billeddannelse (se trin 6.2).
  3. Udfør autofluorescence (AF), fundus fluorescein angiografi (FFA) og optisk sammenhæng tomografi (OCT) ved hjælp af en høj opløsning OKT maskine med en 55 ° felt linse og 30 ° felt linse.
    1. Administrere intravenøs 10% fluorescein (0,1 mL/kg BW) for FFA. For at få et tidligt fasebillede skal du tage et billede inden for 30 s fra injektionen. For et sent fasebillede skal du tage et billede 5-10 min efter injektionen.
  4. Udfør fundus fotografering ved hjælp af en fundus kamera mellem de tidlige og sene faser af FFA.

16. Postoperative overvågningsmetoder for erg-undersøgelser (Full-Field Elektroretinogram)

  1. Hurtigt NHPs natten over. Bedøve NHP før ERG-studier (se trin 4.2 for stof og koncentration for sedation). Under hele ERG-optagelserne skal du genadse sedation, når det er relevant.
  2. Separate multimodale billeddannelser og ERG-optagelser med et interval på mindst 2-3 dage.
  3. Når bedøvet, skal du sikre NHP er mørk-tilpasset i 30 minutter før ERG optagelse.
  4. Placer subdermale nåleelektroder i rustfrit stål i venstre og højre sidekande (referenceelektroder) og bagsiden af NHP-kroppen (jordelektroden). Placer ERG kontaktlinselektroder på NHP hornhinden ved hjælp af vidisisk gel til at støtte kontakt og vedhæftning.
  5. Basere alle ERG-test på de menneskelige protokoller, der anbefales af International Society for Clinical Electrophysiology of Vision (ISCEV)14. Begynd ERG-optagelse under scotopiske forhold og start med lysdæmper blinker. Følg ISCEV's anbefalinger for anbefalede interstimulusintervaller.
  6. Sørg for, at NHP er lystilpasset i 10 minutter før fotopic test, igen ved hjælp af standard ISCEV anbefalinger til baggrundsstyrke.

17. Aktiv dødshjælp af NHP

  1. For at aflive NHP til enucleation, administrere intravenøs natrium pentobarbital (75 mg / kg), som anbefalet af panelet om aktiv dødshjælp af American Veterinary Medical Association.

Representative Results

De multimodale billeddannelsesmetoder (fundusfotografering, fundus autofluorescence imaging (FAF), fundus fluorescein angiography (FFA)-early-phase and late-phase, and optical coherence tomography (OCT)) fremhæver funktionerne i en vellykket submakulær RPE-transplantation (figur 1). Fundus fotografering viser placeringen af RPE graft transplantation på fovea uden migration over tid. FAF billeddannelse viser minimale ændringer i hyper-autofluorescence (demonstreret af hvide, højintensive områder) overlapper RPE graft. Tidlig- og senfaset FFA viser ikke nogen åbenlys lækage (demonstreret af hvide, højintensive områder, der forstørres med tiden) omkring RPE-transplantatet. Indledende billeder på dag 3 viser vinduesfejl på grund af fjernelse af indfødte RPE før graft implantation. Makula OCT billeder viser bevarelsen af ydre retinale lag (især photoreceptor lag) over RPE graft som tiden skrider frem. Hæmatoxylin og eosin farvning viser intakt retinale lag uden tegn på mikrotearer. Bevarelsen af det ydre atomlag over graftens periferi tyder på, at RPE-cellerne udfører deres fysiologiske funktioner til at opretholde fotoreceptorens sundhed.

De intraokulære og eksterne synspunkter på 25/41 G dobbeltbore kanylen fremhæver den mekanisme, hvormed IOP styres under subretinal injektion (figur 2). BSS kommer ind i subretinale rum under subretinal væske injektion via den centrale længere kanyle. Betydelige stigninger i intraokulært tryk får BSS i glashulen til at forlade øjet via kanylens større metalboring. BSS derefter rejser langs kanylen og er til sidst skubbet ud af udgangsporten i nærheden af kanyle hub. For at vurdere, om kanylen fungerer som forventet, skal du sikre dig, at væsken strømmer fra udgangsporten nær kanyleknudepunktet.

MiOCT gør det muligt at visualisere bleb-dimensionerne og en potentiel foveal tåre intraoperativt under foveal løsrivelse (figur 3). Figur 3A1-A3 fremhæver et tilfælde af bleb med en foveal tåre. I figur 3A1, mens den ringere bleb er synlig under det kirurgiske mikroskop, er visualisering af tåre vanskelig. Figur 3A2 viser den langsgående del af en bleb uden tårer. Figur 3A3 viser en foveal tåre ved vurderingen af den lodrette del af bleb. Figur 3B1-B3 viser en succesfuldt skabt bleb uden tilstedeværelsen af tårer.

Fraværet af en betydelig forringelse af ERG-bølgeformene tyder på, at både stang- og keglefotoreceptorers globale funktion opretholdes med subretinale RPE-xenografts (figur 4). ERG-bølgeformene viser nethindens overordnede funktion. Der bør især lægges vægt på A-bølgerne for at bestemme ethvert tab af fotoreceptorfunktion.

Figure 1
Figur 1: Postoperativ in vivo-analyse med multimodal billeddannelse. A) In vivo imaging af venstre øje submakulær RPE graft transplantation (gul på fundus fotografering) på forskellige billeddannelsesmetoder (venstre mod højre kolonner: fundus fotografering, autofluorescence, fundus fluorescein angiografi-tidlig fase, fundus fluorescein angiografi-sen fase, optisk sammenhæng tomografi) for tid peger op til 3 måneder (top til bund rækker: Dag 3, 14; Måned 1, 3). Stjernen på fundus fotografiet angiver stedet for retinotomi; den hvide stiplede pil angiver retningen af linjescanningen. Den gult tegnede form på fundus autofluorescence imaging fremhæver placeringen af transplantationen. De hvide trekanter på OLT-billederne angiver de respektive laterale kanter af transplantatet (i henhold til linjescanningen på farve fundus-billedet). B) Hæmatoxylin og eosinfarvning af transplantationen under attrofisk fovea (på grund af intraoperativ tåre) med lag mærket. Skalastænger = 1 mm i A (autofluorescence- og FA-billeder), 200 μm i A (OKT-billeder) og 100 μm i B. Forkortelser: FA = fundus angiografi; OLT = optisk sammenhæng tomografi; RGC = retinal ganglion celle lag; INL = indre nukleare lag; ONL = ydre atomlag; RPE = retinal pigment epitel. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Intraokulær og ekstern udsigt over den 25/41 G dobbeltborede kanyle. (A) Intraokulært syn på den 25/41 G dobbeltborede kanyle under subretinal bleb-skabelsen. Den hvide pil peger på den længere centrale kanyle til subretinal injektion. Den stiplede pil peger på åbningen af udgangs kanylen, hvorigennem BSS passerer for at forlade øjet. B) Ekstern visning af den dobbelte kanyle på 25/41 G. Stjernen markerer udgangsporten nær kanylenavet, hvorfra den intraokulære BSS drænes. Forkortelse: BSS = afbalanceret saltopløsning. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Intraoperative mikroskopbilleder og miOCT-billeder af subretinale brøler kompliceret af en foveal tåre. (A1) Et intraoperativt mikroskopbillede, der viser positionen af langsgående (blå) og tværgående (røde) scanninger i en bleb med en foveal tåre. (A2) Langsgående miOCT-scanning, der viser en subretinal brøl i fovealområdet (gul pil). (A3) Tværgående miOCT-scanning, der fanger en foveal tåre (hvid pilespids) sammen med en retinotomi (stjerne og en subretinal bleb (gul pil). (B1) Et intraoperativt mikroskopisk billede, der viser placeringen af langsgående (blå) og tværgående (røde) scanninger i en vellykket dannet bleb. (B2) Langsgående miOCT-scanning, der viser en subretinal brøl i fovealområdet (gul pil). (B3) Tværgående miOCT scanning, der viser en succesfuld skabt subretinal bleb med en intakt fovea overlegent (hvid diamant). Forkortelse: miOCT = mikroskopintegreret optisk sammenhængstomografi. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: ERG af RPE xenograft-transplanteret øje. Til funktionel vurdering af nethinden viser ERG-vurderinger i fuld felt af RPE-xenografted eye udført ved baseline (øverste række) og 3 måneder efter transplantationen (nederste række) ingen signifikant effekt af RPE xenograft-transplantationen på nogen reaktions amplituder, timing eller bølgeform under enten mørktilpassede eller lystilpassede forhold. Forkortelser: RPE = retinal pigment epitel; ERG = elektroretinogram; DA = mørk-tilpasset; LA = lystilpasset. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Der er to hovedmetoder, der evalueres for submakulær RPE-transplantation-injektion af en RPE suspension og transplantation af en monolayer RPE graft. En detaljeret sammenligning mellem de to metoder ligger uden for dette manuskripts anvendelsesområde. Transplantationen af en monolag RPE-transplantat kan dog være fordelagtig, da RPE-cellerne er mere organiseret i en monolag end i en suspension. RPE-celler i transplantatet er organiseret i et sammenflyt monolag, der ligner organiseringen af det fysiologiske RPE-cellelag og gør det muligt for de transplanterede RPE-celler at udføre deres fysiologiske funktioner. Dette muliggør mere præcise doseringsparametre sammenlignet med celleaffjedring, hvilket er yderst relevant for lovgivningsarbejde og industriel opskalering.

Levering af RPE-plasteret podes i det subretinale rum kræver omhyggelig manipulation af maculaen og nøjagtig indsættelse af transplantatet i det subretinale rum. Teknologiske fremskridt inden for mikrokirurgi, såsom miOCT, og en bedre forståelse af intraoperativ retinal vævsdynamik har reduceret indlæringskurven af denne procedure. I denne diskussion vil begrundelsen for følgende aspekter blive forklaret: i) præoperativ plasminogen injektion; ii) anvendelse af intraoperativ miOCT iii) anvendelse af en brugerdefineret 41 G dobbeltboret kanyle, lave IOP-indstillinger og PFCL til subretinal bleb-oprettelse iv) skrabning af det oprindelige RPE-cellelag inden transplantationen v) brugen af sirolimus, triamcinolon, doxycyclin og minocyclin for at reducere immunogen afslag fra transplantat.

Præoperative plasminogen injektioner frigive parafoveal retinal vedhæftninger
I de første eksperimenter var det udfordrende at løsne fovea med en enkelt væskebølge. Ved vurdering med miOCT afslørede billederne tilstedeværelsen af parafoveale ydre retinale vedhæftninger til den indfødte RPE sammen med tegn på intraretinal traume20. Disse vedhæftninger kan have ført til en lodret udvidelse af bleb snarere end subretinalvæske bølge breder sig over retinal kontur, hvilket resulterer i foveal traumer. Plasminogen er den inaktive forløber for plasmin, en protease rettet mod fibronectin og laminin. Ocriplasmin er en bioengineered variant af human plasmin, godkendt af Food and Drug Administration (FDA) og Det Europæiske Lægemiddelagentur (EMA) til behandling af symptomatisk vitreomakulær trækkraft med eller uden et samtidig makulahul. Men, postapproval rapporter om cystoid macula ødem udvikling efter ocriplasmin injektion har foreslået en mere omfattende effekt af enzymet på nethinden23.

Selv om de nøjagtige mekanismer ikke er blevet identificeret, blev det foreslået, at plasmin kunne svække retinal vedhæftning gennem nedbrydningen af interphotoreceptor matrix elementer, der er ansvarlige for fotoreceptor-RPE vedhæftning24. I denne protokol, NHP øjne blev behandlet med intravitreal plasminogen 1 uge før operationen for at frigive parafoveal ydre retinale vedhæftninger. Under den antagelse, at photoreceptor-RPE vedhæftning er svækket, en lavere kraft er nødvendig for at løsne neurosensoriske nethinden, herunder distal parafoveal ring, som typisk modstår subretinalvæske bølge20. Således resulterer den kraft, der administreres under nethindens løsrivelse, i udvidelsen af bleb over nethindens kontur i stedet for at strække nethinden tangentielt. Dette reducerer risikoen for foveal tårer. Det skal dog bemærkes, at effekten af plasminogen på langsigtet graft overlevelse ikke blev undersøgt i denne protokol. Fremtidige undersøgelser bør forsøge at bestemme denne effekt.

miOCT giver anatomisk feedback til at guide subretinale bleb skabelse, graft implantation, og subretinale væske dræning
Intraoperativ, atramæmatisk manipulation af macula er nøglen til at opnå gode transplantationsresultater. Men, mikrostrukturelle ændringer af macula relateret til manipulation kan ikke altid være tydeligt på den fungerende mikroskop. I sådanne procedurer er miOCT et vigtigt værktøj, der giver real-time, tredimensionel, intraoperativ feedback af makulastrukturen. miOCT er især nyttig under trinene af foveal løsrivelse, graft implantation og dræning af subretinalvæsken ved hjælp af en væske-luft udveksling. Under foveal løsrivelse kan miOCT bestemme blebens lodrette og vandrette dimensioner. Foveal mikrotearer, som ikke kan visualiseres tydeligt på det kirurgiske mikroskop, kan bekræftes af miOCT (figur 3). Under graft implantation, miOCT billeder guide ved at vise transplantat placering eller nærhed til fovea, gennem ofte mindre gennemsigtig, fritliggende nethinden. miOCT kan også fremhæve mulige områder af nethinde vedhæftning under en vanskelig transplantationsproces25. Endelig, i subretinale væske dræning proces, miOCT kan pålideligt guide subretinale væske dræning indtil fuldstændig retinal-RPE graft kontakt er opnået.

Kombinationen af en dobbeltboret kanyle, lave IOP-indstillinger og PFCL-glasøs tamponade reducerer synergistisk makulatraumer under subretinal bleb-skabelse
Tangentiel nethinde stretching og flydende turbulens kan forekomme under den subretinale BSS injektion for foveal løsrivelse fører til uønskede foveal tårer. For at modvirke disse fænomener har faktorer som den relative position og afstand fra det foveale center, hvor injektionen påbegyndes, injektionsvolumen og hastighed, glasøs tamponade, valg af subretinale instrumentering og IOP alle vist sig at være relevante20,26,27. Den subretinale bleb for foveal løsrivelse bør være placeret på et sted, der er tilstrækkeligt langt væk fra fovea, da nethindestrækning kan være højest på bleb-indvielsesstedet27. IOP bør også holdes lav under hele oprettelsen af subretinaal bleb. Når IOP af øjet er høj, en højere lodret stigning i bleb størrelse snarere end ekspansion langs konturen af nethinden observeres, mens blebs er lavere ved lavere tryk20. Selv om en intravitreal injektion på 50 μL effektivt vil fordoble IOP hos mennesker28 i betragtning af den kortere øjenlængde i NHPs, vil IOP-stigningen under subretinal injektion sandsynligvis være højere og hurtigere end hos mennesker. Mens de fleste vitrektomi maskiner justere for IOP udsving, justeringen er ikke en samtidig, men snarere en reaktiv proces, der opstår som subretinaal injektion provenu. Derfor, jo højere IOP, jo højere er risikoen for retinal overstretching og deraf følgende foveal traumer. Det er derfor vigtigt at opretholde en stabil lav IOP under subretinal injektion.

En kommerciel 20/41 G (DORC) eller en specialfremstillet 25/41 G dobbeltboret subretinale kanyle anbefales til subretinale injektion. Kanylen gør det muligt for væske at forlade glaslegemet hulrum i bytte for BSS injiceres i subretinale rum. Dette sikrer en "samtidig" regulering af IOP under den subretinatale injektion. Et skema over den dobbelte kanyle ses i figur 2. Endelig er PFCL udnyttet til at reducere risikoen for foveal tårer20,26,27. Som PFCLs, såsom octaline, har højere specifik tyngdekraft, de udøver en nedadgående kraft på nethinden under foveal løsrivelse29. Dette stabiliserer yderligere foveal løsrivelse bleb skabelsesprocessen og forbedrer udvidelsen af bleb langs nethinden kontur. Denne teknik er med succes blevet brugt til subretinal injektion af rtPA i indstillingen af massive submakulær blødning på grund af nAMD30.

Pretransplantation fjernelse af indfødte RPE gør det muligt at genoprette RPE-fotoreceptor kompleks
Værts RPE skal fjernes før podningstransplantation. Dette skyldes, at restaureringen af RPE-fotoreceptorkomplekset er påkrævet for at gøre det muligt for RPE-transplantationen at udføre sine fysiologiske funktioner til støtte for fotoreceptorerne21. Værten RPE, hvis den ikke fjernes, kan udgøre som en mekanisk barriere, som forhindrer restaurering af dette kompleks. Det kan fjernes enten gennem administration af RPE-giftige kemikalier eller ved hjælp af fysiske midler til fjernelse. Kemisk fjernelse metoder omfatter systemisk eller subretinaal administration af natrium iodate31,32. Som natrium iodate forårsager udbredt degeneration af fotoreceptorer, RPE celler, og Choriocapillaris når administreres, dens retinale og systemiske toksicitet udelukker dens anvendelse til menneskelige forsøg32,33. Derfor foretrækkes fysiske intraoperative teknikker. Forskellige fysiske metoder er blevet konceptualiseret. Når fysiske metoder anvendes, er det afgørende, at Bruchs membran forbliver ubeskadiget. Mange in vitro-undersøgelser har vist afhængigheden af RPE-transplantatoverlevelse på en intakt Bruchs membran34,35,36.

Forsøg på hydraulisk debridement var forbundet med pauser i Bruchs membran, en øget epiretinal membranudvikling og proliferativ vitreoretinopati, hvilket resulterede i trækhindehindenedrivelse37. En diamant-støvede spatel foreslået for RPE debridement førte også til pauser i Bruch's membran, hvilket resulterer i cellulære spredning fra choroid i subretinale rum38. Interessant nok kunne et skræddersyet udvideligt loopinstrument fjerne den overlydende RPE med bevarelse af Bruchs membran i øjnene på kaniner og grise11,39. Fjernelsen af den underliggende RPE er også nyttig til etablering af dyremodeller med RPE og ydre retinal atrofi, svarende til den avancerede atrofiske form af AMD. Når et fokusområde af RPE fjernes fra maculaen, lukker RPE-såret via hypertrofien i de resterende RPE-celler. Men denne sårheling svar er forbundet med atrofi af det ydre nukleare lag40. Mens oprettelsen af et dyr model er uden for rammerne af dette manuskript, en lignende procedure kan skabe et dyr model af en avanceret atrofisk AMD fænotype til afprøvning af RPE-afledt celle therapeutics.

Brugen af sirolimus, triamcinolon, doxycyclin og minocyclin for at reducere immunogen afslag på transplantat
Det subretinale rum menes at være et immunprivilegeret sted, opretholdt af en intakt blod-retinal barriere og andre faktorer41. I mange undersøgelser, der involverer subretinal transplantation af stamcellederivater med en intakt blod-retinal barriere, immundæmpende lægemidler spiller en ubetydelig rolle i podning overlevelse42. Den ydre blod-retinale barriere menes at være dannet af den indfødte RPE lag og de stramme knudepunkter mellem RPE celler. Mens indfødte RPE fjernelse giver bedre integration af de transplanterede RPE og vært fotoreceptorer, den blod-retinale barriere er forstyrret i processen, hvilket øger sandsynligheden for en immun afvisning. Klassisk, T-celler er centrale for processen med transplantation afvisning af andre organer såsom nyre og lever43. Derfor, indledende immunosuppressive regimer for retinal væv transplantation var rettet mod at reducere disse adaptive immunresponser.

Sirolimus, et mekanistisk mål for rapamycin-hæmmer, og tacrolimus, en kalcineurinhæmmer, er eksempler på immunsuppressive lægemidler rettet mod adaptive immunresponser. Men på trods af tilstrækkelig T-celle undertrykkelse, graft overlevelsesrater forbliver lav. Derudover er RPE-celler kendt for at undertrykke T-celleaktivering gennem frigivelse af hæmmende faktorer og fremme dannelsen af regulatoriske T-cells44. Derfor er det blevet mere og mere tydeligt, at adaptiv immunitet ikke kan være den eneste bidragyder til graft afvisning42. Subretinal transplantation af cellulære produkter kan resultere i akkumulering og aktivering af mikroglia45.

Mikroglia er makrofager af nethinden. De består af to hovedpopulationer: 1) den perivaskulære mikroglia af den indre retinale vaskulatur og 2) mikrogliaen i nethinden vævsparenkym. Da mikroglia er en del af det medfødte immunrespons, kan intravitreale glucocorticoids, såsom triamcinolone, undertrykke cytokinmedieret spredning46. Doxycyclin og minocyclin kan også undertrykke mikroglial aktivering og bør betragtes som47,48. Endelig er forskelle i immunafstødning af RPE-allografter versus xenografts ufuldstændigt forstået49. For eksempel er alloantistoffer mod inducerede pluripotente stamcellebaserede RPE-celler blevet rapporteret i serum af in vivo immunafstødningsmodeller. Men disse antistoffers rolle og betydningen af antistofmedieret afvisning i graftoverlevelsen er stadig ukendt50. Derfor foreslås et multidrug regime udnytte sirolimus til undertrykkelse af adaptive immunitet og en kombination af triamcinolone, doxycyclin, og minocyclin for medfødte immunitet undertrykkelse foreslås. Dette regime er med succes blevet brugt i kaniner med gode graft overlevelsesresultater og minimale systemiske effekter11.

Begrænsninger af denne kirurgiske teknik
Dette papir beskriver en mulig kirurgisk metode til at levere en RPE graft ark i det subretinaale rum NHP; Dette betyder dog ikke, at dette er den eneste optimerede måde. Forskellige vitreo-retinal kirurger kan have andre præferencer for instrumentering og teknik. For eksempel kan dette implantationsenhedsdesign kun levere flade implantater, der understøttes med en stivere cellebærer og derfor muligvis ikke er egnet til relativt fleksible (eller rullede) implantater. RPE suspension transplantationer kan udelade meget af denne teknik. Derfor vil kirurgiske detaljer kræve modifikation baseret på hver leveringsstrategi.

Som interesse i cellulære terapi til behandling af degenerative retinale sygdomme fortsætter med at vokse, NHP dyremodel vil være afgørende i prækliniske undersøgelser for at studere de faktorer, der påvirker RPE graft overlevelse. I dette manuskript foreslås strategier for at muliggøre en glattere levering af en submakulær monolag RPE-graft i NHP-øjet. Metoder til bedre visualisering af intraoperative komplikationer anbefales også. Det forventes, at disse metoder vil fortsætte med at forbedre som brugen af cellulære therapeutics udvider. Fremtidige metodedokumenter bør også overveje at foreslå en omfattende liste over undersøgelser med henblik på at vurdere forskellige strukturelle og funktionelle aspekter af graft.

Disclosures

Boris Stanzel har en amerikansk patent 9980851 på et instrument (RPE skraber), der anvendes i denne undersøgelse. Taler honoraria fra C. Zeiss Meditec og Geuder til Boris Stanzel. De andre forfattere har ingen interessekonflikt at erklære.

Acknowledgments

Denne undersøgelse blev støttet af IAF-PP (HMBS Domain) (OrBID): OculaR BIomaterials and Device, A*STAR, Singapore (H17/01/a0/013), NUS Start-up grant NUHSRO/2016/100/SU/01, NUHS Clinical Scientist Program (NCSP) tilskud og National Research Foundation Competitive Research Programme, Singapore (NRF-CRP21-2018-0008) til X.S., Hong Leong Begavet professorat midler til G.E.H. og B.V.S. Vi vil gerne anerkende veterinærteamet på Translational Pre-Clinical Model Platform (Singapore Eye Research Institute, Singapore) for at yde støtte i NHP kirurgi forberedelse og dyr opfølgning. Vi vil gerne udvide vores påskønnelse til Jill Teo og kolleger fra C. Zeiss Meditec Singapore for teknisk support til OPMI-Lumera 700 med integreret intraoperativ OLT-enhed.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1% Mydriacyl (Tropicamide 1.0%) Sterile Ophthalmic preparation Alcon SIN 4715P Surgical procedure
10% Neutral buffered formalin Leica 3800598 Histology procedure
2.5% Mydfrin (Phenylephrine hydrochloride) Ophthalmic solution Alcon No. 01785 Surgical procedure
25 G AWH Vivid Chandelier Synergetics 56.54.25P Surgical procedure
25 Ga Bi-Blade Vitreous Cutter Combined Wide-Field Stellaris Elite Pack Bausch & Lomb SE5525WVB Surgical procedure
AMO ENDOSOL Balanced Salt Solution for ophthalmic irrigation Abbott Medical Optics 15020 Surgical procedure
Apo-minocycline Apotex Inc 2084104 Immunosuppression
AUROVISC - Hypromellose Ophthalmic Solution USP 2% w/v Aurolab TN 00002387 Surgical procedure
Autoclave MELAG, Vacuklav MELAG 1131-B2300 Surgical procedure
Autostainer XL (ST5010) Leica 2433 Histology procedure
Balanced Saline Solution Beaver Visitec 581732 Surgical procedure
Cotton Bud WINNER MEDICAL 1NA6-100 Surgical procedure
Diagnosys Espion E3 Console Diagnosys 272 Ophthamic imaging
Doxycycline Yung Shin MAL 19950403AEZ Immunosuppression
Eosin Y Merck Millipore 1.15935.0100 Histology procedure
ERG-Jet contact lens electrodes Fabrinal F-06 Ophthamic imaging
Extendable PolyTip Cannula 25 G/38 G MedOne 3247 Surgical procedure
FlexTip Brush (25 g) 1.5 mm MedOne 3222 Surgical procedure
Fluoresceine 10% Faure Curatis AG 5030376 Ophthamic imaging
Gauze Swab WINNER MEDICAL 1NP3275 Surgical procedure
Hamilton gas tight syringe 250 µL Hamilton 81101 Surgical procedure
Heidelberg Spectralis HRA + OCT Computer System Heidelberg Engineering N.A. Ophthamic imaging
Hematoxylin Gill II Merck Millipore 3801520 Histology procedure
Inverted microscope eclipse Ti-E main body (100-240V) Nikon 33131 Histology procedure
Ketamin injection Ceva 37711/58317 Surgical procedure
Lithium carbonate Merck Millipore 1.05680.0250 Histology procedure
Monkey plasminogen Molecular Innovations SKU-CYPLG Surgical procedure
Non-contact wide angled 128 degree fundus lens C. Zeiss Medtech Resight 700 Surgical procedure
Non-woven Ophthalmic Drape Alcon 8065103120 Surgical procedure
Ophthalmic Corneal/Scleral V-Lance Knife 20 G Alcon 8065912001 Surgical procedure
Paraffin Embedding Station Leica EG1150 H Histology procedure
Paraplast High Melt Paraffin Leica 39601095 Histology procedure
Phloxin B Merck Millipore 1.15935.0025 Histology procedure
Prepowdered Surgical Gloves MAXITEX 85-173-2/85-173-3/85-173-4 Surgical procedure
PRODINE Povidone-Iodine Solution BP ICM PHARMA PMLBLP20-01 Surgical procedure
Righton Slit Lamp Model MW50D (RAA133CB) Righton-Oph 5200162 Ophthamic imaging
Rotary microtome Leica RM2255 Histology procedure
Safil Polyglycolic acid, braided, coated, absorbable surgical suture 7/0 B.Braun G1048711 Surgical procedure
SHINCORT I.M. INJ. Triamcinolone Acetonide 40 mg/mL Yung Shin SHI40 SGP-2610015-001 Surgical procedure
Single-Use Hypodermic Needle 21 G B.Braun 4657527 Surgical procedure
Single-Use Hypodermic Needle 23 G B.Braun 4657667 Surgical procedure
Sirolimus Pfizer SIN12034P Immunosuppression
Stainless steel subdermal needle electrode OcuScience F-E2 Ophthamic imaging
Stellaris Elite vision enhancement system Bausch & Lomb BL15455 Surgical procedure
Sterican Single Use Insulin Needles Long Bevel 27 G 12 mm B.Braun 4665406 Surgical procedure
Sterican Single Use Insulin Needles Long Bevel 30 G 12 mm B.Braun 4656300 Surgical procedure
Surgical gown + 2 Hand Towels STERIL APP10 00 01 Surgical procedure
Tegaderm Film 3M 1626W Surgical procedure
TERUMO Syringe 1 cc/mL Luer SlipTip with needle 26 G Teruma SS-01S Surgical procedure
TERUMO Syringe 3 cc/mL Luer LockTip Teruma SS-03L Surgical procedure
TERUMO Syringe 5 cc/mL Luer LockTip Teruma SS-05L Surgical procedure
TobraDex (Tobramycin, Dexamethasone) Sterile Ophthalmic Ointment Alcon No. 01577 Surgical procedure
Topcon Retinal Camera TRC-50DX Topcon 948605 Ophthamic imaging
Vidisic Gel Bausch & Lomb GB41789155517 Surgical procedure
Xylazil-20 Ilium 38653/50276 Surgical procedure
Zeiss Opmi Rescan 700 Carl Zeiss Meditec AG 7210 Surgical procedure

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. Lancet. Global Health. 2 (2), 106-116 (2014).
  2. Verbakel, S. K., et al. Non-syndromic retinitis pigmentosa. Progress in Retinal and Eye Research. 66, 157-186 (2018).
  3. Schwartz, S. D., et al. Human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in patients with age-related macular degeneration and Stargardt's macular dystrophy: follow-up of two open-label phase 1/2 studies. Lancet. 385 (9967), 509-516 (2015).
  4. Kashani, A. H., et al. A bioengineered retinal pigment epithelial monolayer for advanced, dry age-related macular degeneration. Science Translational Medicine. 10 (435), (2018).
  5. da Cruz, L., et al. Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration. Nature Biotechnology. 36 (4), 328-337 (2018).
  6. Mehat, M. S., et al. Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in macular degeneration. Ophthalmology. 125 (11), 1765-1775 (2018).
  7. Mandai, M., et al. Autologous induced stem-cell-derived retinal cells for macular degeneration. New England Journal of Medicine. 376 (11), 1038-1046 (2017).
  8. Sugita, S., et al. HLA-matched allogeneic iPS cells-derived RPE transplantation for macular degeneration. Journal of Clinical Medicine. 9 (7), 2217 (2020).
  9. Gouras, P., Flood, M. T., Kjeldbye, H. Transplantation of cultured human retinal cells to monkey retina. Anais da Academia Brasileira de Ciências. 56 (4), 431-443 (1984).
  10. Koster, C., et al. A systematic review on transplantation studies of the retinal pigment epithelium in animal models. International Journal of Molecular Sciences. 21 (8), 2719 (2020).
  11. Stanzel, B., et al. Surgical approaches for cell therapeutics delivery to the retinal pigment epithelium and retina. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1186, 141-170 (2019).
  12. Kamao, H., et al. Characterization of human induced pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelium cell sheets aiming for clinical application. Stem Cell Reports. 2 (2), 205-218 (2014).
  13. Ben M'Barek, K., et al. Clinical-grade production and safe delivery of human ESC derived RPE sheets in primates and rodents. Biomaterials. 230, 119603 (2020).
  14. Fujii, S., et al. A strategy for personalized treatment of iPS-retinal immune rejections assessed in cynomolgus monkey models. International Journal of Molecular Sciences. 21 (9), 3077 (2020).
  15. Kolb, H., Nelson, R., Ahnelt, P., Ortuño-Lizarán, I., Cuenca, N. The Architecture Of The Human Fovea. Webvision. Moran Eye Center. , Available from: https://webvision.med.utah.edu/book/part-ii-anatomy-and-physiology-of-the-retina/the-architecture-of-the-human-fovea/ (2021).
  16. Francis, P. J., et al. Rhesus monkeys and humans share common susceptibility genes for age-related macular disease. Human Molecular Genetics. 17 (17), 2673-2680 (2008).
  17. Picaud, S., et al. The primate model for understanding and restoring vision. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (52), 26280-26287 (2019).
  18. Pennesi, M. E., Neuringer, M., Courtney, R. J. Animal models of age related macular degeneration. Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 487-509 (2012).
  19. Al-Nawaiseh, S., et al. A step by step protocol for subretinal surgery in rabbits. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (115), e53927 (2016).
  20. Tan, G. S. W., et al. Hints for gentle submacular injection in non-human primates based on intraoperative OCT guidance. Translational Vision Science & Technology. 10 (1), 10 (2021).
  21. Liu, Z., et al. Surgical transplantation of human RPE stem cell-derived RPE monolayers into non-human primates with immunosuppression. Stem Cell Reports. 16 (2), 237-251 (2021).
  22. Stanzel, B. V., et al. Human RPE stem cells grown into polarized RPE monolayers on a polyester matrix are maintained after grafting into rabbit subretinal space. Stem Cell Reports. 2 (1), 64-77 (2014).
  23. Shaikh, M., Miller, J. B., Papakostas, T. D., Husain, D. The efficacy and safety profile of ocriplasmin in vitreomacular interface disorders. Seminars in Ophthalmology. 32 (1), 52-55 (2017).
  24. Johnson, M. W., Fahim, A. T., Rao, R. C. Acute ocriplasmin retinopathy. Retina. 35 (6), 1055-1058 (2015).
  25. Kashani, A. H., et al. Surgical method for implantation of a biosynthetic retinal pigment epithelium monolayer for geographic atrophy: experience from a phase 1/2a study. Ophthalmology. Retina. 4 (3), 264-273 (2020).
  26. Maguire, A. M., et al. Safety and efficacy of gene transfer for Leber's congenital amaurosis. New England Journal of Medicine. 358 (21), 2240-2248 (2008).
  27. Xue, K., Groppe, M., Salvetti, A. P., MacLaren, R. E. Technique of retinal gene therapy: delivery of viral vector into the subretinal space. Eye. 31 (9), 1308-1316 (2017).
  28. Grzybowski, A., et al. Update on intravitreal injections: Euretina Expert Consensus Recommendations. Ophthalmologica. 239 (4), 181-193 (2018).
  29. Wong, D., Williams, R., Stappler, T., Groenewald, C. What pressure is exerted on the retina by heavy tamponade agents. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 243 (5), 474-477 (2005).
  30. Steel, G. B., Kearns, V., Stanzel, B. V., Wong, D. Subretinal injection under perfluorocarbon liquids to avoid foveal dehiscence. Retina. , (2021).
  31. Petrus-Reurer, S., et al. Integration of subretinal suspension transplants of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in a large-eyed model of geographic atrophy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (2), 1314-1322 (2017).
  32. Koh, A. E. -H. Retinal degeneration rat model: A study on the structural and functional changes in the retina following injection of sodium iodate. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 196, 111514 (2019).
  33. Bürgi, H., Schaffner, T. H., Seiler, J. P. The toxicology of iodate: a review of the literature. Thyroid. 11 (5), 449-456 (2001).
  34. Tezel, T. H., Kaplan, H. J., Del Priore, L. V. Fate of human retinal pigment epithelial cells seeded onto layers of human Bruch's membrane. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (2), 467-476 (1999).
  35. Tezel, T. H., Del Priore, L. V. Reattachment to a substrate prevents apoptosis of human retinal pigment epithelium. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 235 (1), 41-47 (1997).
  36. Castellarin, A. A., et al. In vitro transplantation of fetal human retinal pigment epithelial cells onto human cadaver Bruch's membrane. Experimental Eye Research. 66 (1), 49-67 (1998).
  37. Lopez, P. F., et al. Retinal pigment epithelial wound healing in vivo. Archives of Ophthalmology. 113 (11), 1437-1446 (1995).
  38. Lopez, R., Gouras, P., Brittis, M., Kjeldbye, H. Transplantation of cultured rabbit retinal epithelium to rabbit retina using a closed-eye method. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 28 (7), 1131-1137 (1987).
  39. Thieltges, F., et al. Localized RPE removal with a novel instrument aided by viscoelastics in rabbits. Translational Vision Science & Technology. 5 (3), 11 (2016).
  40. Phillips, S. J., et al. Autologous transplantation of retinal pigment epithelium after mechanical debridement of Bruch's membrane. Current Eye Research. 26 (2), 81-88 (2003).
  41. Sugita, S., Mandai, M., Kamao, H., Takahashi, M. Immunological aspects of RPE cell transplantation. Progress in Retinal & Eye Research. , (2021).
  42. Xian, B., Huang, B. The immune response of stem cells in subretinal transplantation. Stem Cell Research & Therapy. 6, 161 (2015).
  43. Issa, F., Schiopu, A., Wood, K. J. Role of T cells in graft rejection and transplantation tolerance. Expert Review of Clinical Immunology. 6 (1), 155-169 (2010).
  44. Yan, F., et al. Transforming growth factor-β2 increases the capacity of retinal pigment epithelial cells to induce the generation of regulatory T cells. Molecular Medicine Reports. 13 (2), 1367-1372 (2016).
  45. Singhal, S., et al. Chondroitin sulfate proteoglycans and microglia prevent migration and integration of grafted Müller stem cells into degenerating retina. Stem Cells. 26 (4), 1074-1082 (2008).
  46. Singhal, S., Lawrence, J. M., Salt, T. E., Khaw, P. T., Limb, G. A. Triamcinolone attenuates macrophage/microglia accumulation associated with NMDA-induced RGC death and facilitates survival of Müller stem cell grafts. Experimental Eye Research. 90 (2), 308-315 (2010).
  47. Santa-Cecília, F. V., et al. Doxycycline suppresses microglial activation by inhibiting the p38 MAPK and NF-kB signaling pathways. Neurotoxicity Research. 29 (4), 447-459 (2016).
  48. Scholz, R., et al. Minocycline counter-regulates pro-inflammatory microglia responses in the retina and protects from degeneration. Journal of Neuroinflammation. 12, 209 (2015).
  49. Sugita, S., Makabe, K., Iwasaki, Y., Fujii, S., Takahashi, M. Natural killer cell inhibition by HLA-E molecules on induced pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (5), 1719-1731 (2018).
  50. Sugita, S., et al. Detection of retinal pigment epithelium-specific antibody in iPSC-derived retinal pigment epithelium transplantation models. Stem Cell Reports. 9 (5), 1501-1515 (2017).

Tags

Medicin udgave 172

Erratum

Formal Correction: Erratum: Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases
Posted by JoVE Editors on 12/29/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases. The Authors section was updated.

The Authors section was updated from:

Ivan Seah*1, Zengping Liu*2,3,4, Daniel Soo Lin Wong3, Wendy Wong1, Graham E. Holder1,3,5, Veluchamy Amutha Barathi3,4,6, Gopal Lingam1,3,4, Xinyi Su1,2,3,4, Boris V. Stanzel1,7,8
1Department of Ophthalmology, National University Hospital, Singapore,
2Institute of Molecular and Cell Biology (IMCB), Agency for Science, Technology and Research (A*STAR),
3Department of Ophthalmology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore,
4Singapore Eye Research Institute (SERI),
5UCL Institute of Ophthalmology,
6Academic Clinical Program in Ophthalmology, Duke-NUS Medical School,
7Macula Center Saar, Eye Clinic Sulzbach, Knappschaft Hospital Saar,
8Department of Ophthalmology, University of Bonn
* These authors contributed equally

to:

Ivan Seah*1,2, Zengping Liu*1,3,4, Daniel Soo Lin Wong1, Wendy Wong2, Graham E. Holder1,2,5, Veluchamy Amutha Barathi1,4,6, Gopal Lingam1,2,4, Xinyi Su1,2,3,4, Boris V. Stanzel1,7,8
1Department of Ophthalmology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore
2Department of Ophthalmology, National University Hospital, Singapore,
3Institute of Molecular and Cell Biology (IMCB), Agency for Science, Technology and Research (A*STAR)
4Singapore Eye Research Institute (SERI),
5UCL Institute of Ophthalmology,
6Academic Clinical Program in Ophthalmology, Duke-NUS Medical School,
7Macula Center Saar, Eye Clinic Sulzbach, Knappschaft Hospital Saar,
8Department of Ophthalmology, University of Bonn
* These authors contributed equally

Retinal Pigment Epitel Transplantation i en ikke-human primat model for degenerative retinale sygdomme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Seah, I., Liu, Z., Soo Lin Wong, D., … More

Seah, I., Liu, Z., Soo Lin Wong, D., Wong, W., Holder, G. E., Amutha Barathi, V., Lingam, G., Su, X., Stanzel, B. V. Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases. J. Vis. Exp. (172), e62638, doi:10.3791/62638 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter