Implantación directa de cánula en la Cisterna Magna de Cerdos
Summary
Este artículo presenta un protocolo paso a paso para la implantación directa de cánulas en la cisterna magna de cerdos.
Abstract
El sistema glinfático es un sistema de eliminación de desechos en el cerebro que depende del flujo de líquido cefalorraquídeo (LCR) en espacios perivasculares unidos a astrocitos y se ha implicado en el aclaramiento de péptidos neurotóxicos como la beta amiloide. La función glinfática deteriorada exacerba la patología de la enfermedad en modelos animales de enfermedades neurodegenerativas, como el Alzheimer, lo que destaca la importancia de comprender este sistema de eliminación. El sistema glinfático a menudo se estudia mediante cánulaciones de cisterna magna (CMc), donde los trazadores se administran directamente en el líquido cefalorraquídeo (LCR). La mayoría de los estudios, sin embargo, se han llevado a cabo en roedores. Aquí, demostramos una adaptación de la técnica CMc en cerdos. Usando CMc en cerdos, el sistema glinfático se puede estudiar a una alta resolución óptica en cerebros giroencefálicos y, al hacerlo, cierra la brecha de conocimiento entre los roedores y los glinfáticos humanos.
Introduction
El líquido cefalorraquídeo (LCR) es un ultrafiltrato de sangre que se encuentra dentro y alrededor del sistema nervioso central (SNC)1,2. Además de dar flotabilidad al cerebro o absorber fuerzas mecánicas dañinas, el LCR también juega un papel fundamental en la eliminación de desechos metabólicos del SNC3. La eliminación de residuos se ve facilitada por el sistema glinfático recientemente caracterizado que permite el flujo convectivo del LCR a través del parénquima cerebral a través de los espacios perivasculares (PVS), que rodean las arterias penetrantes3,4,5. Se ha demostrado que este proceso depende de la acuaporina-4 (AQP4), un canal de agua expresado principalmente en los extremos astrocíticos, unido al PVS4,6. El estudio del sistema glinfático se realiza mediante imágenes tanto in vivo como ex vivo, utilizando microscopía de luz avanzada o resonancia magnética (RM), tras la introducción de un marcador fluorescente/radiactivo o agente de contraste en el LCR7,8,9,10,11.
Una forma eficaz de introducir un trazador en el LCR sin sufrir daños en el parénquima cerebral es a través de la cánulación cisterna magna (CMc)12,13. Una gran mayoría de todos los estudios glinfáticos, hasta ahora se han llevado a cabo en roedores y se han evitado en mamíferos superiores debido a la invasividad de CMc junto con la simplicidad práctica de trabajar con un mamífero pequeño. Además, los delgados cráneos de ratones permiten la obtención de imágenes in vivo sin necesidad de una ventana craneal y, posteriormente, permiten una extracción cerebral sin complicaciones11,14. Los experimentos realizados en humanos han arrojado valiosos datos macroscópicos in vivo sobre la función glinfática, pero se han basado en inyecciones de trazadores intratecales en la columna lumbar distal y, además, utilizan resonancia magnética que no produce la resolución suficiente para capturar la microanatomía del sistema glinfático7,15,16 . Comprender la arquitectura y la extensión del sistema glinfático en mamíferos superiores es esencial para su traducción a los humanos. Para facilitar la traducción glinfática a los seres humanos, es importante aplicar técnicas que se llevan a cabo en roedores a mamíferos superiores para permitir comparaciones directas del sistema glinfático entre especies de creciente cognición y complejidad cerebral17. Los cerebros de cerdos y humanos son giroencefálicos, poseen una neuroarquitectura plegada, mientras que los cerebros de roedores son lisencefálicos, por lo que tienen una diferencia sustancial entre sí. En términos del tamaño total, los cerebros de cerdo son, también, más comparables a los humanos, siendo 10-15 veces más pequeños que el cerebro humano, mientras que los cerebros de ratón son 3.000 veces más pequeños18. Al comprender mejor el sistema glinfático en grandes mamíferos, puede ser posible utilizar el sistema glinfático humano para futuras intervenciones terapéuticas en afecciones como accidente cerebrovascular, lesión cerebral traumática y neurodegeneración. CMc directo en cerdos in vivo es un método que permite la microscopía de luz de alta resolución del sistema glinfático en un mamífero superior. Además, debido al tamaño de los cerdos utilizados, es posible aplicar sistemas de monitoreo similares a los utilizados en cirugías humanas, lo que hace posible documentar y regular estrechamente las funciones vitales para evaluar cómo estas contribuyen a la función glinfática.
Protocol
Representative Results
Discussion
A continuación, se describe, un protocolo detallado para realizar la canulación directa de la cisterna magna en cerdos, incluyendo la preparación necesaria, procedimiento quirúrgico, infusión trazadora y extracción del cerebro. Esto requiere de alguien con experiencia y certificación para trabajar con animales grandes. Si se lleva a cabo correctamente, esto permite la entrega de moléculas deseadas con garantía directamente en el LCR, después de lo cual se pueden utilizar una serie de diferentes modalidades avan…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Knut y Alice Wallenberg, Hjärnfonden, las Fundaciones Wenner Gren y la Fundación Crafoord.
Materials
| 0.01% azide in PBS | Sigmaaldrich | S2002 | |
| 18G needle | Mediq | ||
| 1ml Syringe | FischerSci | 15849152 | |
| 20G cannula | Mediq | NA | |
| 22G cannula | Mediq | NA | |
| 4% paraformaldehyde | Sigmaaldrich | P6148 | |
| Anatomical forceps | NA | NA | |
| Bovine serum albumin Alexa-Fluor 647 Conjugate | ThermoFischer | A34785 | 2 vials (10mg) |
| CaCl2 | Sigmaaldrich | C1016 | |
| Chisel | ClasOhlson | 40-8870 | |
| Dental cement | Agnthos | 7508 | |
| compact saw | ClasOhlson | 40-9517 | |
| Glucose | Sigmaaldrich | G8270 | |
| Hammer | ClasOhlson | 40-7694 | |
| Insta-Set CA Accelerator | BSI-Inc | BSI-151 | |
| IV line TAP, 3-WAYS with 10cm extension | Bbraun | NA | |
| KCl | Sigmaaldrich | P9333 | |
| Marker pen | NA | NA | |
| MgCl2 | Sigmaaldrich | M8266 | |
| MilliQ water | NA | NA | |
| NaCL | Sigmaaldrich | S7653 | |
| NaH2PO4 | Sigmaaldrich | S8282 | |
| NaHCO3 | Sigmaaldrich | S5761 | |
| No. 20 scalpel blade | Agnthos | BB520 | |
| No. 21 Scalpel blade | Agnthos | BB521 | |
| No. 4 Scalpel handle | Agnthos | 10004-13 | |
| Saline | Mediq | NA | |
| Salmon knife | Fiskers | NA | |
| Self-retaining retractors | NA | NA | |
| Superglue | NA | NA | |
| Surgical curved scissors | NA | NA | |
| Surgical forceps | NA | NA | |
| Surgical towel clamps | NA | NA |
References
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