Directe canule-implantatie in de Cisterna Magna van varkens
Summary
Dit artikel presenteert een stap-voor-stap protocol voor de directe canule implantatie in de cisterna magna van varkens.
Abstract
Het glymfatische systeem is een afvalopruimingssysteem in de hersenen dat afhankelijk is van de stroom van hersenvocht (CSF) in astrocytengebonden perivasculaire ruimtes en is betrokken bij de klaring van neurotoxische peptiden zoals amyloïde-bèta. Verminderde glymfatische functie verergert de ziektepathologie in diermodellen van neurodegeneratieve ziekten, zoals de ziekte van Alzheimer, wat het belang van het begrijpen van dit klaringssysteem benadrukt. Het glymfatische systeem wordt vaak bestudeerd door cisterna magna cannulaties (CMc), waarbij tracers rechtstreeks in het hersenvocht (CSF) worden afgeleverd. De meeste studies zijn echter uitgevoerd bij knaagdieren. Hier demonstreren we een aanpassing van de CMc-techniek bij varkens. Met behulp van CMc bij varkens kan het glymfatische systeem met een hoge optische resolutie in gyrencephalische hersenen worden bestudeerd en daarmee de kenniskloof tussen knaagdier en menselijke glymfatica overbruggen.
Introduction
Hersenvocht (CSF) is een ultrafiltraat van bloed dat wordt aangetroffen in en rond het centrale zenuwstelsel (CZS)1,2. Afgezien van het geven van drijfvermogen aan de hersenen of het absorberen van schadelijke mechanische krachten, speelt CSF ook een cruciale rol bij het opruimen van metabolisch afval uit het CZS3. Afvalopruiming wordt vergemakkelijkt door het recent gekarakteriseerde glymfatische systeem dat de convectieve stroom van CSF door het hersenparenchym mogelijk maakt via perivasculaire ruimten (PVS), die doordringende slagaders omringen3,4,5. Van dit proces is aangetoond dat het afhankelijk is van aquaporine-4 (AQP4), een waterkanaal dat voornamelijk wordt uitgedrukt op de astrocytische eindvoet, gebonden aan de PVS4,6. De studie van het glymfatische systeem wordt bereikt door zowel in vivo als ex vivo beeldvorming, met behulp van geavanceerde lichtmicroscopie of magnetische resonantie beeldvorming (MRI), na de introductie van een fluorescerende / radioactieve tracer of contrastmiddel in de LIQUOR7,8,9,10,11.
Een effectieve manier om een tracer in de liquor te introduceren zonder schade aan het hersenparenchym op te lopen, is door middel van cisterna magna cannulation (CMc)12,13. Een grote meerderheid van alle glymfatische studies tot nu toe zijn uitgevoerd bij knaagdieren en vermeden bij hogere zoogdieren vanwege de invasiviteit van CMc in combinatie met de praktische eenvoud van het werken met een klein zoogdier. Bovendien maken de dunne schedels van muizen in vivo beeldvorming mogelijk zonder dat een schedelvenster nodig is en maken vervolgens een ongecompliceerde hersenextractie mogelijk11,14. Experimenten uitgevoerd bij mensen hebben waardevolle macroscopische in vivo gegevens opgeleverd over de glymfatische functie, maar vertrouwden op intrathecale tracere injecties in de distale lumbale wervelkolom en maakten bovendien gebruik van MRI die niet voldoende resolutie oplevert om de microanatomie het glymfatische systeem vast te leggen7,15,16 . Het begrijpen van de architectuur en omvang van het glymfatische systeem bij hogere zoogdieren is essentieel voor de vertaling naar de mens. Om de vertaling van glymfatische stoffen naar mensen te vergemakkelijken, is het belangrijk om technieken die worden uitgevoerd bij knaagdieren toe te passen op hogere zoogdieren om directe vergelijkingen van het glymfatische systeem tussen soorten met toenemende cognitie en hersencomplexiteit mogelijk te maken17. Varkens- en menselijke hersenen zijn gyrencephalisch en bezitten een gevouwen neuroarchitectuur, terwijl knaagdierhersenen dissident zijn, waardoor ze aanzienlijk van elkaar verschillen. In termen van de totale grootte zijn varkenshersenen ook meer vergelijkbaar met mensen, 10-15 keer kleiner dan het menselijk brein, terwijl muizenhersenen 3.000 keer kleiner zijn18. Door het glymfatische systeem bij grote zoogdieren beter te begrijpen, kan het mogelijk zijn om het menselijke glymfatische systeem te gebruiken voor toekomstige therapeutische interventie bij aandoeningen zoals beroerte, traumatisch hersenletsel en neurodegeneratie. Direct CMc bij varkens in vivo is een methode die de hoge resolutie lichtmicroscopie van het glymfatische systeem in een hoger zoogdier mogelijk maakt. Bovendien is het vanwege de grootte van de gebruikte varkens mogelijk om monitoringsystemen toe te passen die vergelijkbaar zijn met die welke worden gebruikt bij menselijke operaties, waardoor het mogelijk is om vitale functies strak te documenteren en te reguleren om te beoordelen hoe deze bijdragen aan de glymfatische functie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hierin wordt een gedetailleerd protocol beschreven om de directe cannulatie van de cisterna magna bij varkens uit te voeren, inclusief de noodzakelijke voorbereiding, chirurgische procedure, tracerdifusie en extractie van de hersenen. Dit vereist iemand met ervaring en certificering voor het werken met grote dieren. Indien correct uitgevoerd, maakt dit de levering van gewenste moleculen met zekerheid rechtstreeks in de liquor mogelijk, waarna een reeks verschillende geavanceerde lichtbeeldvormingsmodaliteiten kan worden …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de Knut and Alice Wallenberg Foundation, Hjärnfonden, Wenner Gren Foundations en de Crafoord foundation.
Materials
| 0.01% azide in PBS | Sigmaaldrich | S2002 | |
| 18G needle | Mediq | ||
| 1ml Syringe | FischerSci | 15849152 | |
| 20G cannula | Mediq | NA | |
| 22G cannula | Mediq | NA | |
| 4% paraformaldehyde | Sigmaaldrich | P6148 | |
| Anatomical forceps | NA | NA | |
| Bovine serum albumin Alexa-Fluor 647 Conjugate | ThermoFischer | A34785 | 2 vials (10mg) |
| CaCl2 | Sigmaaldrich | C1016 | |
| Chisel | ClasOhlson | 40-8870 | |
| Dental cement | Agnthos | 7508 | |
| compact saw | ClasOhlson | 40-9517 | |
| Glucose | Sigmaaldrich | G8270 | |
| Hammer | ClasOhlson | 40-7694 | |
| Insta-Set CA Accelerator | BSI-Inc | BSI-151 | |
| IV line TAP, 3-WAYS with 10cm extension | Bbraun | NA | |
| KCl | Sigmaaldrich | P9333 | |
| Marker pen | NA | NA | |
| MgCl2 | Sigmaaldrich | M8266 | |
| MilliQ water | NA | NA | |
| NaCL | Sigmaaldrich | S7653 | |
| NaH2PO4 | Sigmaaldrich | S8282 | |
| NaHCO3 | Sigmaaldrich | S5761 | |
| No. 20 scalpel blade | Agnthos | BB520 | |
| No. 21 Scalpel blade | Agnthos | BB521 | |
| No. 4 Scalpel handle | Agnthos | 10004-13 | |
| Saline | Mediq | NA | |
| Salmon knife | Fiskers | NA | |
| Self-retaining retractors | NA | NA | |
| Superglue | NA | NA | |
| Surgical curved scissors | NA | NA | |
| Surgical forceps | NA | NA | |
| Surgical towel clamps | NA | NA |
References
- Redzic, Z. B., Segal, M. B. The structure of the choroid plexus and the physiology of the choroid plexus epithelium. Advanced Drug Delivery Reviews. 56 (12), 1695-1716 (2004).
- Sakka, L., Coll, G., Chazal, J. Anatomy and physiology of cerebrospinal fluid. European Annals of Otorhinolaryngology, Head and Neck Diseases. 128 (6), 309-316 (2011).
- Nedergaard, M. Garbage truck of the brain. Science. 340 (6140), 1529-1530 (2013).
- Iliff, J. J., et al. A Paravascular pathway facilitates csf flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid B. Science Translational Medicine. 4 (147), (2012).
- Xie, L., et al. Sleep drives metabolite clearance from the Adult Brain. Science. 342 (6156), 373-378 (2013).
- Mestre, H., et al. Aquaporin-4-dependent glymphatic solute transport in the rodent brain. eLife. 7, 40070 (2018).
- Ringstad, G., et al. Brain-wide glymphatic enhancement and clearance in humans assessed with MRI. JCI Insight. 3 (13), 121537 (2018).
- Lundgaard, I., Wang, W., Eberhardt, A., Vinitsky, H. S., Cameron, B. Beneficial effects of low alcohol exposure, but adverse effects of high alcohol intake on glymphatic function. Scientific Reports. , 1-16 (2018).
- Munk, A. S., et al. PDGF-B is required for development of the glymphatic system. Cell Reports. 26 (11), 2955-2969 (2019).
- Plog, B. A., et al. Transcranial optical imaging reveals a pathway for optimizing the delivery of immunotherapeutics to the brain. JCI Insight. 3 (20), 1-15 (2018).
- Bechet, N. B., et al. Light sheet fluorescence micrscopy of optically cleared brains for studying the glymphatic system. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 40 (10), 1975-1986 (2020).
- Xavier, A. L. R., et al. Cannula implantation into the cisterna magna of rodents. Journal of Visualized Experiments. (135), e57378 (2018).
- Ramos, M., et al. Cisterna magna injection in rats to study glymphatic function. Methods in Molecular Biology. 1938, (2019).
- Sweeney, A. M., et al. in vivo imaging of cerebrospinal fluid transport through the intact mouse skull using fluorescence macroscopy. Journal of visualized experiments. (149), e59774 (2019).
- Eide, P. K., Ringstad, G. MRI with intrathecal MRI gadolinium contrast medium administration: A possible method to assess glymphatic function in human brain. Acta Radiologica Open. 4 (11), 205846011560963 (2015).
- Ringstad, G., Vatnehol, S. A. S., Eide, P. K. Glymphatic MRI in idiopathic normal pressure hydrocephalus. Brain. 140 (10), 2691-2705 (2017).
- Kornum, B. R., Knudsen, G. M. Cognitive testing of pigs (Sus scrofa) in translational biobehavioral research. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 35 (3), 437-451 (2011).
- Bèchet, N. B., Shanbhag, N. C., Lundgaard, I. Glymphatic function in the gyrencephalic brain. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. , (2021).
- Raghunandan, A., et al. Bulk flow of cerebrospinal fluid observed in periarterial spaces is not an artifact of injection. bioRxiv. , (2020).
- D’Angelo, A., et al. Spinal fluid collection technique from the atlanto-occipital space in pigs. Acta Veterinaria Brno. 78 (2), 303-305 (2009).
- Ma, Q., et al. Rapid lymphatic efflux limits cerebrospinal fluid flow to the brain. Acta Neuropathologica. 137 (1), 151-165 (2019).
- Hablitz, L. M., et al. Increased glymphatic influx is correlated with high EEG delta power and low heart rate in mice under anesthesia. Science Advances. 5 (2), 5447 (2019).
- Mestre, H., et al. Flow of cerebrospinal fluid is driven by arterial pulsations and is reduced in hypertension. Nature Communications. 9 (1), 4878 (2018).
- Pleticha, J., et al. Pig lumbar spine anatomy and imaging-guided lateral lumbar puncture: A new large animal model for intrathecal drug delivery. Journal of Neuroscience Methods. 216 (1), 10-15 (2013).
