Diferenciación y polarización de macrófagos en un fenotipo similar a M2 utilizando una línea celular de leucemia THP-1 similar a monocitos humanos
Summary
Los macrófagos asociados a tumores (TAM) similares a M2 se asocian con progresión tumoral y mal pronóstico en el cáncer. Este protocolo sirve como una guía detallada para diferenciar y polarizar de manera reproducible las células similares a los monocitos THP-1 en macrófagos similares a M2 en un plazo de 14 días. Este modelo es la base para investigar los efectos antiinflamatorios de la TAM dentro del microambiente tumoral.
Abstract
Los macrófagos asociados a tumores (TAM) pueden cambiar su expresión y perfil de citoquinas de acuerdo con los estímulos externos. Esta notable plasticidad permite a TAM adaptarse a los cambios en curso dentro del microambiente tumoral. Los macrófagos pueden tener principalmente atributos proinflamatorios (similares a M1) o antiinflamatorios (similares a M2) y pueden cambiar continuamente entre estos dos estados principales. Los macrófagos similares a M2 dentro del entorno tumoral se asocian con la progresión del cáncer y el mal pronóstico en varios tipos de cáncer. Se utilizan muchos métodos diferentes para inducir la diferenciación y polarización de las células THP-1 para investigar los mecanismos celulares e intercelulares y los efectos de TAM dentro del microambiente de los tumores. Actualmente, no existe un modelo establecido para la polarización de macrófagos similares a M2 utilizando la línea celular THP-1, y los resultados de la expresión y los perfiles de citoquinas de los macrófagos debido a ciertos estímulos in vitro varían entre los estudios. Este protocolo sirve como guía detallada para diferenciar las células similares a los monocitos THP-1 en macrófagos M0 y para polarizar aún más las células en un fenotipo similar a M2 dentro de los 14 días. Demostramos los cambios morfológicos de células similares a monocitos THP-1, macrófagos diferenciados y macrófagos polarizados similares a M2 utilizando microscopía de luz. Este modelo es la base para los modelos de línea celular que investigan los efectos antiinflamatorios de TAM y sus interacciones con otras poblaciones celulares del microambiente tumoral.
Introduction
Los macrófagos asociados a tumores (TAM) y su papel en la inflamación crónica, la aparición del cáncer y el desarrollo de tumores son objetivos importantes en investigaciones recientes1,2. Los monocitos de sangre periférica que se reclutan en el microambiente tisular del tumor en desarrollo se diferencian en macrófagos y pueden polarizarse en dos subtipos principales de macrófagos3. El macrófago activado clásicamente representa el fenotipo M1 principalmente proinflamatorio y el subtipo similar a M2 activado alternativamente muestra características predominantemente antiinflamatorias4. Los macrófagos pueden cambiar dinámicamente entre estos dos fenotipos principales dependiendo de su metabolismo celular, con subtipos intermedios que tienen atributos inflamatorios y antiinflamatorios5. TAM representa una población heterogénea de ambos fenotipos. Sin embargo, una función promotora de tumores y un mal pronóstico en diferentes tipos de cáncer se asocian particularmente con macrófagos similares a M26,7,8.
Los perfiles funcionales de los macrófagos y su interacción con otras células dentro del microambiente tumoral son complejos y difíciles de capturar en un entorno en constante cambio durante el desarrollo continuo del tumor. Las líneas celulares pueden proporcionar una población celular homogénea con viabilidad estable en cultivo, lo que puede facilitar el proceso de demostración de mecanismos celulares e intercelulares definidos. La línea celular THP-1 similar a un monocitos es un sistema modelo legítimo para monocitos humanos primarios9. Esta línea celular inmortalizada espontáneamente se ha obtenido de la sangre periférica de un lactante de un año con leucemia monocítica aguda9,10. La diferenciación y polarización de las células THP-1 han sido reportadas por varios estudios y se han realizado de múltiples maneras diferentes11,12,13,14. La activación y, por tanto, la polarización de los macrófagos en un fenotipo tipo M1 es seguida por un mecanismo de rebote antiinflamatorio compensatorio, promoviendo un fenotipo tipo M2 a través de citoquinas producidas por macrófagos inflamatorios, como la interleucina 6 (IL-6) o el itaconato15,16. Esto podría servir como un mecanismo de ruptura para atenuar una respuesta inflamatoria excesiva después de la activación celular17. El proceso de diferenciar y polarizar monocitos y células similares a monocitos THP-1 en un fenotipo antiinflamatorio similar a M2 también se acompaña de estímulos proinflamatorios que deben superarse. Una respuesta inflamatoria de citoquinas puede ser causada por estrés mecánico18,como cambiar los medios para realimentar las células, o agregar compuestos químicos para diferenciar las células THP-1, como forbol 12-miristato 13-acetato (PMA), e inducir la producción de factor de necrosis tumoral α (TNFα), interleucina 1β (IL-1β) o IL-619. Este perfil alterado de expresión de citoquinas como respuesta a la PMA puede afectar y prevenir la polarización posterior de los macrófagos20. Los períodos de descanso adecuados, como se informó antes después del tratamiento con PMA, permiten que estas respuestas inflamatorias disminuyan y faciliten la polarización celular en un fenotipo 21 distinto similar aM2.
Este protocolo demuestra un método para diferenciar y polarizar las células similares a los monocitos THP-1 en un fenotipo de macrófagos similar a M2 en un plazo de 14 días.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo sobre la diferenciación y polarización de células similares a monocitos THP-1 en 14 días proporciona un método para obtener macrófagos con un fenotipo distinto similar a M2 debido a la incubación de células de tratamiento prolongado con períodos de descanso adecuados entre pasos.
Ciertos pasos son críticos para este protocolo. El tiempo de duplicación de los monocitos THP-1 es de aproximadamente 26 h. Las células se pueden dividir a una densidad celular de 9 x10…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El Instituto Price de Investigación Quirúrgica de la Universidad de Louisville, cuenta con el apoyo financiero de John W. Price y Barbara Thruston Atwood Price Trust. Las fuentes de financiación no tuvieron ningún papel en el diseño y la realización del estudio, así como en la recopilación, gestión, análisis e interpretación de los datos.
Materials
| 0.4% trypan blue | VWR, Radnor, USA | 152-5061 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | USA Scientific, Ocala, USA | 1615-5510 | |
| 10 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-898 | |
| 1000 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1111-2821 | |
| 15 mL Centrifuge tube | VWR, Radnor, USA | 89039-664 | |
| 20 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1120-1810 | |
| 200 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1120-8810 | |
| 25 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-900 | |
| 5 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-896 | |
| 50 mL Centrifuge tube | VWR, Radnor, USA | 89039-662 | |
| Accutase solution 500 mL | Sigma, St. Louis, USA | A6964 | |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100x), stabilized | Sigma, St. Louis, USA | A5955-100 mL | with 10,000 units penicillin, 10 mg of streptomycin and 25 μg of amphotericin B per mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| Binder CO2 Incubator | VWR, Radnor, USA | C170-ULE3 | |
| CytoOne T-75cm flask with filter cap | USA Scientific, Ocala, USA | CC7682-4875 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma, St. Louis, USA | D8537-500 mL | PBS without calcium chloride and magnesium chloride should be used, since both can alter macrophage polarization |
| Eppendorf Centrifuge 5804 R (refrigerated) | Eppendorf, Enfield, USA | – | |
| Ethyl alcohol (70%) | – | – | |
| FACSCalibur flow cytometer | BD Biosciences, San Diego, USA | – | The flow cytometer operates with CellQuest software (BD Biosciences) |
| Falcon 24-well plate | VWR, Radnor, USA | 353504 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ATCC, Manassas, USA | 30-2020 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD14 | BD Biosciences, San Diego, USA | 555397 | Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests) |
| FITC Mouse Anti-Human CD80 | BD Pharmingen, San Diego, USA | 557226 | Flow cytometry, M1 marker (100 tests) |
| FITC Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD Pharmingen, San Diego, USA | 555748 | Flow cytometry, isotype control for CD80 (100 tests) |
| FITC Mouse IgG2a, κ Isotype Control | BD Biosciences, San Diego, USA | 553456 | Flow cytometry, isotype control for CD14 (100 tests) |
| Human BD Fc Block | BD Biosciences, San Diego, USA | 564220 | Flow cytometry, Fc block (0.25 mg) |
| Human interleukin 13 (IL-13) | R&D, Minneapolis, USA | IL-771-10 μg | |
| Human interleukin 4 (IL-4) | R&D, Minneapolis, USA | SRP3093-20 μg | |
| Labconco Biosafety Cabinet (Delta Series 36212/36213) | Labconco, Kansas City, USA | – | |
| L-Glutamine Solution, 200 mM | ATCC, Manassas, USA | 30-2214 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) from E. coli 0111:B4 | Sigma, St. Louis, USA | L2630-100 mg | |
| Mini Cell Scrapers | Biotium, Fremont, USA | 22003 | |
| Neubauer hemocytometer | Fisher Scientific, Waltham, USA | 02-671-5 | |
| Nikon Eclipse inverted microscope TS100 | Nikon, Melville, USA | – | |
| Nuclease-free water | Invitrogen, Carlsbad, USA | AM9937 | |
| Olympus Light Microscope RH-2 | Microscope Central, Feasterville, USA | 40888 | |
| P10 variable pipet- Gilson | VWR, Radnor, USA | 76180-014 | |
| P1000 variable pipet-Gilson | VWR, Radnor, USA | 76177-990 | |
| P200 variable pipet- Gilson | VWR, Radnor, USA | 76177-988 | |
| PE Mouse Anti-Human CD11b | BD Biosciences, San Diego, USA | 555388 | Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests) |
| PE Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences, San Diego, USA | 555749 | Flow cytometry, isotype control for CD11b (100 tests) |
| PE-Cy 5 Mouse Anti-Human CD206 | BD Pharmingen, San Diego, USA | 551136 | Flow cytometry, M2 marker (100 tests) |
| PE-Cy 5 Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD Pharmingen, San Diego, USA | 555750 | Flow cytometry, isotype control for CD206 (100 tests) |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma, St. Louis, USA | P8139 | |
| Powerpette Plus pipettor | VWR, Radnor, USA | 75856-448 | |
| Precision Water bath (model 183) | Precision Scientific, Chicago, USA | 66551 | |
| RPMI-1640 Medium | ATCC, Manassas, USA | 30-2001 | |
| THP-1 cell line, American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC, Manassas, USA | TIB-202 |
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