Summary
يتم وصف بروتوكولات مفصلة خطوة بخطوة هنا لدراسة الإشارات الميكانيكية في المختبر باستخدام خلايا القمم العصبية O9-1 متعددة القدرات وهيدروجيلات البولي أكريلاميد ذات صلابة متفاوتة.
Abstract
خلايا القمة العصبية (NCCs) هي خلايا متعددة القدرات الجنينية الفقارية التي يمكن أن تهاجر وتفرق إلى مجموعة واسعة من أنواع الخلايا التي تؤدي إلى مختلف الأعضاء والأنسجة. تصلب الأنسجة تنتج القوة الميكانيكية, جديلة المادية التي تلعب دورا حاسما في التمايز NCC; ومع ذلك، لا تزال الآلية غير واضحة. توفر الطريقة الموصوفة هنا معلومات مفصلة للجيل الأمثل من الهيدروجيلات البولي أكريلاميد ذات صلابة متفاوتة ، والقياس الدقيق لمثل هذه التصلب ، وتقييم تأثير الإشارات الميكانيكية في خلايا O9-1 ، وهو خط NCC يحاكي في أجهزة NCCs الحية.
تم قياس تصلب الهيدروجيل باستخدام المجهر القوة الذرية (AFM) وأشار إلى مستويات صلابة مختلفة وفقا لذلك. وأظهرت مركبات الكربون الهيدروفلورية من نوع O9-1 المستزرعة على الهيدروجيلات ذات التصلب المتفاوت مورفولوجيا الخلايا المختلفة والتعبير الجيني عن ألياف الإجهاد، مما يشير إلى آثار بيولوجية متفاوتة ناجمة عن تغيرات الإشارة الميكانيكية. وعلاوة على ذلك، أثبت هذا أن تغيير صلابة الهيدروجيل أدى إلى نظام فعال في المختبر للتلاعب بالإشارة الميكانيكية عن طريق تغيير صلابة الجل وتحليل التنظيم الجزيئي والجيني في NCCs. O9-1 NCCs يمكن أن تفرق إلى مجموعة واسعة من أنواع الخلايا تحت تأثير وسائل الإعلام التمايز المقابلة، وأنه من المناسب للتلاعب الإشارات الكيميائية في المختبر. لذلك ، فإن هذا النظام في المختبر هو أداة قوية لدراسة دور الإشارات الميكانيكية في NCCs وتفاعلها مع الإشارات الكيميائية ، مما سيساعد الباحثين على فهم أفضل للآليات الجزيئية والجينية لتطوير القمة العصبية والأمراض.
Introduction
خلايا القمة العصبية (NCCs) هي مجموعة من الخلايا الجذعية أثناء تكوين الأجنة الفقارية مع قدرة ملحوظة على الهجرة والمساهمة في تطوير مختلف الأعضاء والأنسجة. يمكن أن تفرق NCCs إلى أنواع مختلفة من الخلايا ، بما في ذلك الخلايا العصبية الحسية والغضاريف والعظام والخلايا الصباغية وخلايا العضلات الملساء ، اعتمادا على موقع المنشأ المحوري والتوجيه البيئي المحلي ل NCC1،2. مع القدرة على التفريق إلى مجموعة واسعة من أنواع الخلايا، يمكن أن تؤدي التشوهات الوراثية التي تسبب خلل التنظيم في أي مرحلة من مراحل التنمية العصبية (NC) إلى العديد من الأمراض الخلقية2. على سبيل المثال، تؤدي الاضطرابات أثناء تكوين الأمراض غير السارية وهجرتها وتطورها إلى اضطرابات تنموية تعرف مجتمعة باسم اعتلالات الأعصاب1و3. تتراوح هذه الأمراض من العيوب القحفية بسبب الفشل في تكوين NCC ، مثل متلازمة Treacher Collins ، إلى تطور أنواع السرطان المختلفة بسبب قدرة NCC على الهجرة النقيلية ، كما رأينا في سرطان الجلد3و4و5و6. على مدى العقود القليلة الماضية، حقق الباحثون اكتشافات ملحوظة حول أدوار وآليات NCCs في التنمية والأمراض، مع تركيز غالبية النتائج على الإشارات الكيميائية7،8. في الآونة الأخيرة، وقد أشير إشارات الميكانيكية للعب دور حاسم ولكن غير مفهومة بشكل جيد في تطوير NCC9،10.
وتلعب الإشارات البيئية للبلدان غير الوطنية دورا حاسما أثناء تطورها، بما في ذلك تنظيم تمايز الخلايا غير المكلورة عبر المحيطات إلى أنواع مختلفة من الخلايا. تؤثر الإشارات البيئية، مثل الإشارات المادية، على السلوكيات المحورية والاستجابات الخلوية، مثل التنويع الوظيفي. Mechanotransduction يسمح للخلايا لاستشعار والاستجابة لتلك الإشارات للحفاظ على العمليات البيولوجية المختلفة2. تحيط NCCs بالخلايا المجاورة والركائز المختلفة ، مثل المصفوفة خارج الخلية (ECM) ، والتي يمكن أن تؤدي إلى محفزات ميكانيكية للحفاظ على التوازن والتكيف مع التغييرات من خلال تحديد المصير والانتشار وموت الخلايا المبرمج11. يبدأ التحويث الميكانيكي في غشاء البلازما حيث يحدث المكون الحسي للمحفزات الميكانيكية خارج الخلية ، مما يؤدي إلى التنظيم داخل الخلية12. Integrins، الالتصاقات البؤرية، وتقاطعات غشاء البلازما تتابع الإشارات الميكانيكية، مثل قوى القص، والإجهاد، وتصلب الركائز المحيطة بها، إلى إشارات كيميائية لإنتاج الاستجابات الخلوية12. يتم نقل الإشارات الكيميائية من غشاء البلازما إلى التنظيم الخلوي النهائي عبر مسارات إشارات مختلفة لوضع اللمسات الأخيرة على العمليات الحيوية للكائن الحي ، مثل التمايز.
وقد اقترحت العديد من الدراسات أن الإشارات الميكانيكية من صلابة الركيزة يلعب دورا في تمايز الخلية13،14. على سبيل المثال، أظهرت الدراسات السابقة أن الخلايا الجذعية المتوسطة (MSCs) نمت على ركائز لينة مع تصلب مماثلة لتلك التي من أنسجة الدماغ (في نطاق 0.1-1.0 كيلو باسكال) أدى إلى تمايز الخلايا العصبية15،16. ومع ذلك، أكثر MSCs تفرق في الخلايا الشبيهة بالخلايا العضلية عندما نمت على ركائز 8-17 كيلو باسكال تحاكي تصلب العضلات، في حين لوحظ التمايز مثل العظام عندما تم استزراع MSCs على ركائز قاسية (25-40 كيلو باسكال)15،16. وتبرز أهمية الميكانوترانسدوكشن من خلال المخالفات والتشوهات في مسار الإشارات الميكانيكية التي يحتمل أن تؤدي إلى عيوب وأمراض النمو الحادة، بما في ذلك السرطان وأمراض القلب والأوعية الدموية وهشاشة العظام17و18و19. في السرطانات ، يكون نسيج الثدي الطبيعي ناعما ، ويزيد خطر الإصابة بسرطان الثدي في أنسجة الثدي الصلبة والكثيفة ، وهي بيئة أقرب إلى أورام الثدي15. مع هذه المعرفة ، يمكن دراسة آثار الإشارات الميكانيكية على تطوير NCC من خلال التلاعب البسيط بصلابة الركيزة من خلال نظام في المختبر ، مما يوفر المزيد من المزايا والإمكانيات في فهم أساسيات تطور الأمراض المرتبطة بال NC والمسببات.
لدراسة تأثير الإشارات الميكانيكية في المركبات غير السارية، أنشأنا نظاما فعالا في المختبر للمركبات غير السارية على أساس تحسين الأساليب المنشورة سابقا وتقييم استجابات ال NCCs للإشارات الميكانيكية المختلفة20و21. 10- وقدم بروتوكول مفصل لإعداد وتقييم تيبس الهيدروجيل متفاوتة لتأثير الإشارات الميكانيكية في البلدان غير الوطنية. ولتحقيق ذلك، تستخدم مركبات الكربون الهيدروفلورية من طراز O9-1 كنموذج NC لدراسة الآثار والتغيرات استجابة للهيدروجلز الصلبة مقابل الهيدروجيلات اللينة. O9-1 NCCs هي خط خلايا NC مستقر معزول عن جنين الفأر (E) في اليوم 8.5. O9-1 NCCs تحاكي NCCs في الجسم الحي لأنها يمكن أن تفرق إلى أنواع مختلفة من الخلايا المشتقة من NC في وسائط التمايزالمحددة 22. لدراسة الإشارات الميكانيكية للمركبات غير السارية ، تم تصنيع ركيزة مصفوفة بمرونة غير قادرة من تركيزات مختلفة من حلول الأكريلاميد والبيس أكريلاميد لتحقيق الصلابة المطلوبة ، ترتبط بصلابة الركيزة البيولوجية20،21،23. لتحسين شروط ركيزة المصفوفة ل NCCs ، وتحديدا خلايا O9-1 ، تم إجراء تعديلات من البروتوكول المنشور سابقا20. وكان أحد التغييرات التي أجريت في هذا البروتوكول لاحتضان الهيدروجيلات في الكولاجين الأول، المخفف في حمض الخليك 0.2٪ بدلا من 50 mM HEPES، في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. انخفاض درجة الحموضة من حمض الخليك يؤدي إلى توزيع متجانسة وارتفاع الكولاجين أنا التأسيس، مما يسمح لمرفق أكثر اتساقا من البروتين ECM24. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام مزيج من مصل الحصان ومصل الأبقار الجنينية (FBS) بتركيزات 10٪ و 5٪ في محلول ملحي عازل للفوسفات (PBS) ، على التوالي ، قبل تخزين الهيدروجيلات في الحاضنة. تم استخدام مصل الحصان كمكمل إضافي لFBS بسبب قدرته على تعزيز انتشار الخلايا والتمايز بتركيز 10٪25.
مع هذه الطريقة، تم محاكاة البيئة البيولوجية من قبل طلاء البروتين ECM (على سبيل المثال، الكولاجين I) لخلق بيئة دقيقة في المختبر لNCCs لتنمو والبقاء على قيد الحياة20،21. تم تحليل صلابة الهيدروجيلات المعدة كميا عن طريق المجهر للقوة الذرية (AFM) ، وهي تقنية معروفة لتصوير المغير المرن26. لدراسة تأثير مستويات صلابة مختلفة على NCCs، تم استزراع الخلايا البرية O9-1 وإعدادها على الهيدروجيلات للفلورية المناعية (IF) تلطيخ ضد أكتين خيوط (F-actin) لإظهار الاختلافات في الالتصاق بالخلايا ومورفولوجيس استجابة للتغيرات في صلابة الركيزة. وباستخدام هذا النظام المختبري، سيتمكن الباحثون من دراسة أدوار الإشارات الميكانيكية في المركبات غير السارية وتفاعلها مع الإشارات الكيميائية الأخرى للحصول على فهم أعمق للعلاقة بين المركبات غير السارية والإشارات الميكانيكية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد هيدروجيل
ملاحظة: يجب تنفيذ جميع الخطوات في غطاء محرك السيارة ثقافة الخلية التي تم تطهيرها مع الإيثانول والأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) تعقيمها قبل استخدامها للحفاظ على العقم. يجب رش الأدوات، مثل الملاقط والمواسير، بالإيثانول. يجب أيضا أن تكون حلول المخزن المؤقت معقمة- تصفية.
- إعداد الأغطية الزجاجية المغلفة بالأحماض الأمينوسيلينية
- ضع العدد المطلوب من الأغطية الزجاجية على قطعة من المسح المختبري.
ملاحظة: تحضير إضافية 3-4 coverlips لضمان مستلزمات النسخ الاحتياطي كافية كما أنها كسر بسهولة. مواد مختلفة من الزجاج coverlips سوف تسفر عن توافق مختلف من البذر الخلية والتعلق. من الأفضل تحديد النوع الذي يناسب التجربة بشكل أفضل قبل بدء التجارب (انظر جدول المواد). - استخدام الموقد الكحول أو الموقد بونسن لتعقيم كل coverslip عن طريق تمريرها ذهابا وإيابا من خلال اللهب (30 ق لتجارب فحص البروتين). ضع كل غطاء زجاجي على مسحة مختبرية لتبرد.
- بمجرد تبريد الأغطية الزجاجية ، قم بنقلها إلى طبق بيتري مبطن بالبارافيلم لمنع الانزلاق.
ملاحظة: إذا كانت الأغطية ليست باردة بما فيه الكفاية، فإن الحرارة المتبقية تذوب البارافيلم على زلات، مما يجعلها غير صالحة للاستعمال. - تغطية الأغطية مع ما يقرب من 200 ميكرولتر و 800 ميكرولتر من 0.1 M NaOH ل12 ملم و25 ملم coverslip، على التوالي، والسماح لهم الجلوس لمدة 5 دقائق. ثم يستنشق 0.1 M NaOH والسماح للأغطية للهواء الجاف لمدة 5 دقائق أخرى لتشكيل فيلم حتى.
- بمجرد تجفيف الأغطية، ماصة ما يقرب من 80 ميكرولتر و 150 ميكرولتر من ثلاثي إيثوكسيسيل 3-أمينوبروبيل (APTS) ل12 ملم و 25 ملم يغطي، على التوالي. كن حذرا لتجنب تسرب الحل على parafilm. السماح للحل للجلوس لمدة 5 دقائق.
- يستنشق أكبر قدر ممكن من APTS الزائدة والسماح APTS المتبقية لتجف لمدة 5 دقائق. شطف الأغطية جيدا عن طريق غمرها في العقيمة، deionized (DI) H2O ثلاث مرات لمدة 5 دقائق في كل مرة.
ملاحظة: إذا لم يتم شطف الأغطية الزجاجية بشكل جيد ، فإن APTS المتبقية تسبب ردود فعل غير مرغوب فيها مع الجلوتارانديهيد ، مما يسبب عجلة بيضاء لتشكيل مما يؤدي إلى أغطية غير صالحة للاستعمال. - نقل الأغطية إلى طبق بيتري جديد مع الجانب التفاعلي التي تواجه. إضافة ما يكفي من 0.5٪ glutaraldehyde إلى طبق بيتري لتغطية الأغطية تماما والسماح للأغطية للجلوس لمدة 30 دقيقة.
- يستنشق 0.5٪ غلوتارالدهيد وشطف الأغطية مرة أخرى في DI H2O مرة واحدة لمدة 3 دقائق. تعيين الجانب التفاعلي coverslips حتى على مسح المختبر أو طبق بيتري نظيفة لتجف الهواء تماما قبل الاستخدام.
ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا; يجب وضع الأغطية في معقمة DI H2O حتى الاستخدام.
- ضع العدد المطلوب من الأغطية الزجاجية على قطعة من المسح المختبري.
- إعداد الأغطية السيليكونية
- ضع نفس العدد من الأغطية مثل الأغطية المغلفة بال أمينوسيلين (الخطوة 1.1.1) في طبق بيتري مبطن بالبارافيلم.
- ماصة 40 ميكرولتر أو 150 ميكرولتر لأغطية 12 ملم و 25 ملم، على التوالي، من ثنائي كلورو ميثيلسيلسيلين (DCMS) إلى جانب واحد من غطاء والسماح للحل للجلوس لمدة 5 دقائق.
- يستنشق أي محلول متبقي من غطاء الغطاء ، ويغسل في DI H2O العقيم مرة واحدة لمدة دقيقة واحدة ، ووضع الأغطية التفاعلية على مسح المختبر لتجف الهواء تماما قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
- إعداد الهيدروجيلات
- مزيج الأكريلاميد، بيس أكريلاميد، وDI H2O في أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل لإعداد 500 ميكرولتر من الحلول مع صلابة متفاوتة (انظر الجدول 1). دوامة الحل لمدة 30 ق لمزجها جيدا.
- العمل بسرعة، إضافة محلول كبريتات الأمونيوم 10٪ (APS) وتيتراثيل إيثيلينديامين (تيميد) إلى الأنبوب ودوامة الحلول مرة أخرى لخلط الحلول.
ملاحظة: إعداد الطازجة 10٪ وكالة الأنباء الجزائرية وتركها على الجليد أو تجميد في aliquots استخدام واحد بسبب تجميد الحساسة / دورة ذوبان الجليد. - ماصة ما يقرب من 33 ميكرولتر أو 100 ميكرولتر من الحل على المجففة 12 ملم أو 25 ملم أمينوسيلين المغلفة coverlips (القسم 1.1) ، على التوالي.
- باستخدام ملاقط منحنية ، ضع على الفور غطاء الأغطية المعالج DCMS على رأس محلول الجل مع الجانب المعالج الذي يلمس محلول الجل ، وبالتالي وضع محلول الجل بين غطاء الأغطية المعالج من DCMS وأغطية الأغطية المغلفة بال أمينوسيلين.
- السماح للمحلول هلام لبوليمرة لمدة 5-15 دقيقة، في حين رصد بنشاط لالبوليمرة هلام من بقايا الحل في الأنبوب.
- بمجرد بلمرة الجل ، افصل غطاء DCMS المعالج بالملاقط المنحنية أو شفرة الحلاقة ، تاركا الجل متصلا بالزلاقة المغلفة بالأحماض الأمينوسيلانية الأصلية.
- ضع على الفور غطاء مع الهيدروجيل المرفقة في لوحة محددة سلفا 4-well/24-well و6-well مغطاة 500 ميكرولتر و 2 مل من برنامج تلفزيوني معقم أو DI H2O لأغطية 12 مم و 25 ملم، على التوالي، لمنع الجل من الجفاف.
- كرر الخطوات 1.3.4-1.3.7 لجميع الأغطية.
- غمر الهيدروجيلات في برنامج تلفزيوني معقم أو DI H2O لمدة 30 دقيقة لإزالة محلول الأكريلاميد الزائد. تخزين الهيدروجيلات في برنامج تلفزيوني معقم أو DI H2O في 4 درجة مئوية لوقف الإجرائية هنا.
- في غرفة مظلمة، وإعداد خليط الهيكسانوات (السلفو-سانباه) من قبل 4'-azido-2'-nitrophenylamino) خليط الهيكسانوات (السلفو-سانباه) عن طريق خلط 2.5 مل من 50 م 2-[4-(2-هيدروكسي إيثيل) بيبيرازين-1-yl] حمض الإيثانسلفونيك (HEPES) (درجة الحموضة = 8.5) مع 25 ميكرولتر من 50 ميكروغرام/مل سولفو-سانباه في أنبوب مخروطي، ملفوفة في رقائق الألومنيوم للحماية من الضوء. استخدام ماصة لخلط الحل جيدا قبل استخدام.
ملاحظة: حجم 2.5 مل من محلول السلفو-سانباه يكفي لما يقرب من خمسة وعشرين هيدروجيلس 12 ملم أو خمسة هيدروجيلات 25 ملم. - أسبيرات برنامج تلفزيوني أو DI H2O من لوحة البئر. أضف ما يقرب من 100 ميكرولتر أو 500 ميكرولتر للأغطية مقاس 12 مم و25 مم على التوالي من محلول sulfo-SANPAH (الخطوة 1.3.10) لتغطية الجل. تأكد من أن الحل يغطي الجل بالكامل.
ملاحظة: ضبط قوة شفط فراغ لمنع القوة القوية من تمزيق أو إزعاج الهيدروجيل. - ضع المواد الهلامية مع الحل تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية 15 واط، 365 نانومتر لمدة 10 دقائق، وكشف للحد من أي تدخل من ضوء الأشعة فوق البنفسجية تتفاعل مع sulfo-SANPAH.
- يستنشق السلفو-سانباه الزائدة عن طريق إمالة لوحة لجمع أكبر قدر ممكن من الحل. غسل الجل مع 50 MM HEPES مرتين إلى ثلاث مرات.
- إضافة 500 ميكرولتر و 2 مل ل12 مم و 25 مم هلام، على التوالي، من 50 ملغ / مل الكولاجين أنا المخفف في حمض الخليك 0.2٪ إلى كل بئر تحتوي على الهيدروجيل. السماح للجل لاحتضان بين عشية وضحاها في حاضنة 37 درجة مئوية، 5٪ CO2.
ملاحظة: تمييع الكولاجين I في 0.2٪ حمض الخليك بدلا من 50 mM HEPES لتعزيز التوزيع المتجانس والتعلق من الكولاجين I. - يستنشق الكولاجين أنا ويغسل المواد الهلامية مع برنامج تلفزيوني معقم ثلاث مرات لإزالة الكولاجين الزائد I لمدة 5 دقائق كل غسل. احتضان الهيدروجيلات في برنامج تلفزيوني مع مصل الحصان 10٪، 5٪ FBS لمدة 2 ساعة في حاضنة 37 درجة مئوية، 5٪ CO2.
ملاحظة: إضافة مصل حصان 10٪ يعزز انتشار أعلى مقارنة باستخدام FBS فقط كما فعلت في المنشور السابق. - يستنشق الوسط. إضافة 500 مل من دولبيكو المصفاة المعقمة النسر المتوسطة المعدلة (DMEM) مع 10٪ FBS و 1٪ البنسلين-streptomycin (P /S) إلى كل بئر. تخزين المواد الهلامية في 37 درجة مئوية، 5٪ حاضنة CO2 حتى جاهزة لثقافة الخلية.
- مرة واحدة جاهزة، لوحة ما يقرب من 1.5 × 104 O9-1 الخلايا / سم2 في المتوسط القاعدي في أطباق الثقافة. احتضان الخلايا لمدة يومين في حاضنة عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO2. تحقق من الخلايا للالتقاء للتأكد من أن الخلايا مرتبطة بما فيه الكفاية بالمواد الهلامية ، وأن عدد الخلايا يكفي قبل جمعها للتحليل.
ملاحظة: راجع البروتوكول المنشور مسبقا للحصول على خطوات الاسترداد والمرور، ومجموعة من خلايا O9-120. - انتقل إلى الأقسام 2 أو 3 أو 4 لمزيد من التحليل للهيدروجلز.
2. التحليل الكمي للتصلب عبر AFM
- بدء تشغيل الكمبيوتر نظام AFM، تليها وحدة تحكم AFM (انظر جدول المواد).
- جبل cantilever AFM على حامل التحقيق AFM. استخدام كانتيليفر كروية مع حبة السيليكا 0.5 ميكرومتر التي شنت في نهاية cantilever (cantilever مع حبة كروية).
ملاحظة: بالنسبة للهيدروجيلات الأكثر صلابة، مثل 10 كيلو باسكال و20 كيلو باسكال و40 كيلو باسكال، تم استخدام مسبار أكثر صلابة مع ثابت الربيع 0.24 N/m. واستخدم مسبار أكثر ليونة للهيدروجيلات الأكثر ليونة، مثل 0.5 كيلو باسكال و1 كيلو باسكال، مع ثابت ربيعي قدره 0.059 N/m. - تعيين برنامج AFM تحت وضع الاتصال.
- قم بتركيب رقاقة السيليكون على مرحلة عينة AFM لجمع منحنيات القوة من خلال النقر على Engage للكانتيليفر للمس ركيزة السيليكون ، وبالتالي توليد منحنيات القوة.
- استخدام منحنيات القوة أعلاه (2.4) للمعايرة، انقر على معايرة في البرنامج المسيطر للحصول على متوسط ثابت الربيع من cantilever تحت شرط اللحن الحراري، وحفظ القيم معايرة في البرنامج المسيطر.
- قم بتركيب العينات عن طريق وضع غطاء الغطاء مع الهيدروجيل المرفق في طبق بيتري مقاس 60 مم على مرحلة المسح الضوئي AFM. أضف 3 مل من برنامج تلفزيوني إلى الطبق قبل إجراء القياسات لمنع الجل من الجفاف.
- قم بتعيين AFM للعمل في وضع الاتصال (السائل) لبدء القياس. إشراك حبة كروية للمس باستمرار ورفع من عينة هلام.
- تعيين cantilever بحيث عتبة انحراف لها لا يزال في 10 نانومتر. الحفاظ على حجم المنحدرة من التحقيق في 10 ميكرومتر. ثم قم بتسجيل منحنيات القوة كما في الخطوة 2.4.
- الحصول على ما لا يقل عن 20 منحنيات القوة من 3 إلى 10 بقع مختلفة على الأقل عبر سطح الهيدروجيل.
- حساب متوسط معامل يونغ من ~ 20 منحنيات القوة لكل بقعة مع التصوير AFM وبرامج التحليل. استخدام تمديد منحنى قوة المنحدر ونموذج خطي (كروي). حساب متوسط جميع البقع لكل عينة لتسفر عن صلابة النهائي.
ملاحظة: يتم حفظ معامل Young والبيانات ذات الصلة(أي الانحرافات المعيارية) تلقائيا كجداول بيانات. - كرر الخطوات 2.6-2.10 لجميع العينات.
3. التحليل الجزيئي للتصلب عن طريق تلطيخ immunofluorescence
- استخدم الملاقط لنقل الغطاء إلى لوحة جديدة لتقليل الإشارات الخاطئة من الخلايا التي تزرع مباشرة على اللوحة. غسل الخلايا مع 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني عقيم ثلاث مرات لإزالة الخلايا الميتة وأي وسيلة الثقافة المتبقية.
- إصلاح الخلايا باستخدام 500 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالديهايد (PFA) لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، دون عائق. ثم، إعادة غسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني / جيدا لمدة 2 دقيقة لكل منهما.
ملاحظة: يخزن عند درجة حرارة 4 درجات مئوية للتوقف الإجرائي. - علاج الخلايا مع 500 ميكرولتر من 0.1٪ تريتون X-100 لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم، وغسل الخلايا ثلاث مرات مع 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني / جيدا.
- منع الخلايا مع 250 ميكرولتر من مصل الحمير 10٪ (المخفف في برنامج تلفزيوني و 0.1٪ توين 20) لكل بئر لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- احتضان الخلايا مع 250 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية. ثم غسل الخلايا ثلاث مرات مع 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني / جيدا لمدة 5 دقائق لكل منهما.
ملاحظة: تم استخدام مضاد فينكولين (Vcl) (1:250) ومكافحة AP2 ألفا (1:250) في هذه التجربة وتم تخفيفها في مصل الحمير بنسبة 10٪. - احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الثانوية المقابلة و / أو phalloidin المستخدمة لتلطيخ F-actin في تخفيف 1:400 في 250 ميكرولتر من مصل الحمير 10٪ لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم، غسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل منهما.
ملاحظة: يمكن أن يكون 568 نانومتر Phalloidin تشارك في احتضان مع 488 نانومتر أو 647 نانومتر الأجسام المضادة الثانوية أو من تلقاء نفسها. - احتضان الخلايا مع 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1:1000 التخفيف) في 250 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة تليها غسل آخر واحد من برنامج تلفزيوني لمدة 2 دقيقة.
- إضافة 3-4 قطرات من تصاعد المتوسطة إلى كل بئر. تخزين العينات في 4 درجة مئوية لتعيين لمدة 2 ساعة على الأقل قبل التصوير لضمان وضع المتوسطة تصاعد بشكل صحيح.
- التقاط صور لما لا يقل عن 3 إطارات عشوائية لكل عينة هيدروجيل مع مجهر مضان ، مما ينتج قنوات فردية ومندمجة.
4. الكم في الوقت الحقيقي PCR (RT-qPCR)
- نقل الهيدروجيلات مع الخلايا الملتصقة لجمع الحمض النووي الريبي إلى لوحة جديدة لتقليل الحمض النووي الريبي غير المرغوب فيه من الخلايا المرفقة بلوحة الخلية. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات لإزالة الخلايا الميتة والثقافة المتوسطة.
- استخراج mRNA مجموع باستخدام عدة استخراج الجيش الملكي النيبالي. إجراء النسخ العكسي من الحمض النووي الريبي إلى cDNA باستخدام supermix النسخ العكسي اتباع تعليمات الشركة المصنعة.
- أداء RT-qPCR مع التمهيديات لVCL كعلامة صلابة الاختيار وتحليل باستخدام طريقة 2-ΔΔCT.
ملاحظة: التسلسل التمهيدي ل Vcl: إلى الأمام 5 'GCTTCAGTCAGACCCATACTCG 3'; عكس 5 'AGGTAAGCAGTAGGTCAGATGT 3'.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
إعداد هيدروجيل وتقييم صلابة من خلال AFM ونموذج هيرتز
هنا، يتم توفير بروتوكول مفصل لتوليد هيدروجيلات البولي أكريلاميد من صلابة متفاوتة من خلال تنظيم نسبة الأكريلاميد والبيس أكريلاميد. ومع ذلك، فإن هيدروجيلات البولي أكريلاميد ليست جاهزة لتصاق الخلايا بسبب نقص بروتينات ECM. وهكذا، sulfo-SANPAH، بوصفها رابط، يربط بشكل متناقض إلى الهيدروجيل ويتفاعل مع الأمينات الأولية من بروتينات ECM للسماح الالتصاق من البروتينات ECM إلى أسطح الهيدروجيل عبر إسترN-هيدروكسيسوتشينيميد في السلفو-سانباه بعد تنشيط الأشعة فوق البنفسجية. نوع الكولاجين كنت تستخدم كبروتين ECM الاختيار لتعزيز فعالية مرفق الخلية O9-1. لضمان قيم صلابة دقيقة من الهيدروجيلات المختلفة ، تم إجراء تقييم صلابة باستخدام AFM ، وهي تقنية معروفة لتصوير المغير المرن.
عند تشكيل ناجحة والتعلق من هيدروجيل البولي أكريلاميد إلى غطاء الزجاج، وظل الجل ملتزمة coverslip مع سطح حتى والحد الأدنى من تمزيق. تم قياس صلابة من قبل AFM على أساس مبدأ تقنية المسافة البادئة، حيث تم تطبيق المسافة البادئة قاسية على العينة مع القوة المطلوبة للوصول إلى عمق المسافة البادئة26. مع هذا القياس، تم حساب معامل الشباب المرن على أساس المسافة البادئة للعمق والقوة في نموذج هيرتز، وهي نظرية مرنة26. ومع ذلك ، نظرا للتباين الكبير في النتائج من قبل AFM ، تم تطبيق طريقة إحصائية إضافية للحصول على نتيجة كمية مع الحد الأدنى من تأثير الأسطح غير المستوية والتجانس الناقص لحلول الجل26. لإنتاج قياس كمي باستخدام AFM ، تم أخذ تجميع ما لا يقل عن 50 منحنى قوة والمسافة من كل موقع على عينة الجل لمتوسط تصلب العينة. كانت القوة المطبقة على هلام الصلابة العالية أعلى من تلك المطبقة على الجل الأكثر ليونة ، مما يشير إلى أن الركيزة الأكثر صلابة أسفرت عن منحدر أكثر انحدارا في الرسم البياني Force vs. Z ، حيث يتم قياس القوة بالنون ، ويشير Z إلى عمق المسافة البادئة بين المسافة البادئة والعينة.
على الهيدروجيلات الناعمة، كان منحدر منحنى القوة المتولدة لطيفا حيث كانت القوة المطلوبة من مسبار AFM أقل(الشكل 1A). ومع ذلك ، على hydrogels قاسية ، مثل تلك التي مع معامل 40 كيلو باسكال ، وكان المنحدر ولدت أكثر حدة بكثير كما كانت القوة المطبقة أعلى من ليونة المواد الهلامية(الشكل 1B). كما يقلل الفصل بين المسبار وعينة الهيدروجيل، يزيد المنحنى بشكل كبير مع تلامس طرف المسبار غطاء الزجاج. ومع ذلك، كلما زادت مسافة الفصل، يقترب المنحنى من 0 فقط حيث لا توجد قوة تطبيقية موجودة.
كما هو مبين في الشكل 1A، اقترب الكانتلر على مسبار AFM من الجل ، المشار إليه بالخط الأزرق ، وقاس المسبار القوة التطبيقية المطلوبة لاختراق عينة الجل والوصول في نهاية المطاف إلى غطاء الزجاج ، مما تسبب في زيادة مفاجئة في القوة. بسبب الأخطاء الإجرائية وال مفيدة ممكنة، مثل نوعية الحلول المطلوبة، صلابة حقيقية من عينات هيدروجيل يختلف إلى حد كبير وبعيدا عن صلابة المطلوب. وبالتالي، فإن AFM أداة مفيدة للتحقق من صحة المنهجية وتأكيدها مع منع عرض البيانات الكاذبة في تجارب أخرى.
وفي هذا التقييم، تم قياس عينات الهيدروجيل الخمس المعدة من خلال النهج الكمي. وركز البروتوكول على مستويات تصلب الهيدروجيل من 0.5 كيلو باسكال، 1 كيلو باسكال، 10 كيلو باسكال، 20 كيلو باسكال، و 40 كيلو باسكال، والتي تحاكي اتساع مستويات صلابة الركيزة البيولوجية المبلغ عنها للتمايز بين أنواع الخلايا المختلفة. واستخدمت منحنيات القوة التي تم الحصول عليها من قياسات AFM لتوليد معامل الشباب المرن في الكيلوباسكالس باستخدام برنامج خوارزمية تحليل AFM(الشكل 2).
مقارنة بين أنظمة هيدروجيل البولي أكريلاميد وأنواع الخلايا
هذا التكيف من البروتوكول الأصلي من قبل TSE وزملاؤه يوفر نهجا فعالا وفعالا لدراسة الجوانب الحساسة للميكانوسين من NCC باستخدام خلايا O9-120. وتشمل التعديلات على البروتوكول السابق تعديل حضانة بروتين ECM: استبدال 50 mM HEPES بحمض الخليك بنسبة 0.2٪ وإضافة مصل الحصان بنسبة 10٪ وFBS لثقافة الخلايا (الخطوة 1.3.14-1.3.15). وقد تم التحقق من صحة هذه التعديلات من خلال مقارنة نمو وصيانة مركبات الكربون الهيدروفلورية O9-1 على هذا النظام الهلامي المعدل مع ذلك في البروتوكول الأصلي (السيطرة). هنا، قمنا باستزراع خلايا O9-1 البرية على كل من أنظمة الهيدروجيل مع معامل مرن من 1 كيلو باسكال و 40 كيلو باسكال لكل نظام في الوسط القاعدي. تم تصور حالة نمو الخلايا الإجمالية وتطورها باستخدام مجهر الضوء الساطع للخصائص المبرمج ، والمورفولوجيا المجهدة ، وتعلق الخلية بالهيدروجلز. O9-1 الخلايا نمت على نظام هلام الأصلي أدى إلى عدد أكبر من الخلايا الميتة المشار إليها من قبل فائض من الخلايا المستديرة (الشكل 3E, F) لكل من 1 كيلو باسكال و 40 كيلو باسكال هيدروجيلس.
في المقابل، أظهرت خلايا O9-1 التي نمت على نظام الجل المعدل نموا صحيا للخلايا وتعلقا كافيا بالركيزة الهيدروجيلية(الشكل 3G، H). وبالإضافة إلى ذلك، تم تقييم مدى توافق المركبات غير السارية مع نظام الهيدروجيل المعدل عن طريق إجراء تلطيخ IF لعلامة NCC، Tcfap2α (AP-2). AP-2 هو عامل النسخ أعرب في نسب NC لتنظيم التنمية في أجنة الفئران، مما يجعلها مناسبة لتقييم التوافق27. على الرغم من أن خلايا O9-1 نمت على أنظمة التحكم والهيدروجيل المعدلة على حد سواء أعرب AP-2، كانت هناك زيادة كبيرة في التعبير AP-2 في الخلايا O9-1 مطلي على نظام الهيدروجيل المعدلة، كما هو مبين من قبل إشارة مضان أقوى والتحديد الكمي المقابلة(الشكل 4A،B).
بالإضافة إلى ذلك، تم استخدام خلايا P19 لزيادة التحقق من صحة فوائد نظام الهيدروجيل المعدل لنمو الخلايا. P19 هو خط خلايا سرطان جنيني مشتق من سرطان المسخ المشتقة من الجنين في الماوس28. باستخدام بروتوكول الثقافة المقابلة، نمت خلايا P19 على كل من أنظمة التحكم والهيدروجيل المعدلة لرصد خصائص البقاء والنمو. وكشف التصوير برايتفيلد أن الخلايا P19 مطلي على كل من نظم الهيدروجيل عرض فائض من الخلايا العائمة المستديرة وعدم وجود ملحقات ركيزة الخلية(الشكل 3A-D). وتشير هذه الملاحظة إلى أن البروتوكول المعدل كان أكثر ملاءمة لمركبات الكربون الهيدروفلورية من نوع O9-1 لدراسة الإشارات الميكانيكية في البلدان غير الحكومية.
تصور التعبير عن الألياف عالية الإجهاد على ركائز قاسية
الهيدروجيل المعدلة يسمح للتحليل الكمي والنوعي للاختلافات في مورفولوجيا الخلايا المستزرعة على المواد الهلامية من مستويات صلابة مختلفة وغيرها من العوامل. وبمجرد أن كانت الهيدروجيلات جاهزة لزرع الخلايا، تم تمرير خلايا O9-1 البرية على الهيدروجيلات ذات مستويات صلابة مختلفة. تم رصد الخلايا لصحتها ونموها من خلال مراقبة شكلها وانتشارها المكاني وحتى التعلق على الهيدروجيل مع الحد الأدنى من الخلايا الميتة. وقد أظهرت بعض الدراسات زيادة في ألياف الإجهاد والتصاق الخلايا لMSCs على ركائز عالية الصلابة، مما يشير إلى أن NCCs نمت على ركيزة أكثر صلابة سوف تظهر أيضا نتائج مماثلة بالمقارنة مع NCCs نمت على ركائز ليونة29،30.
F-أكتين جنبا إلى جنب مع الميسين الثاني, α-أكتينين, وغيرها من البروتينات الهيكل الخلوي ومن المعروف جماعيا كما ألياف الإجهاد31. لاحظت الدراسات السابقة زيادة في تجميع ألياف الإجهاد استجابة لزيادة القوة الميكانيكية31. في أحد طرفي ألياف الإجهاد أو كليهما، تتيح المرفقات بمجمع الالتصاق البؤري للخلايا الهجرة والالتزام ب ECM31. Phalloidin تلطيخ لتصور F-actin التعبير والتنظيم في NCCs أظهرت نمو الخلايا صحية استجابة للإشارات الميكانيكية(الشكل 5). بالإضافة إلى ذلك، أظهرت خلايا O9-1 التي تزرع على هيدروجيلات منخفضة أو عالية الصلابة مورفولوجيا مختلفة من خلال كميات مختلفة من ألياف الإجهاد(الشكل 5). على غرار الملاحظات من الدراسات المبلغ عنها التي أجريت باستخدام MSCs، لوحظ أن خلايا O9-1 نمت على ركيزة أكثر صلابة، 40 كيلو باسكال، أظهرت المزيد من ألياف الإجهاد وكانت منتشرة بشكل جيد مقارنة بالخلايا التي تزرع على هيدروجيل أكثر ليونة، وأشار إلى صلابة 1 كيلو باسكال29،30.
تقييم التصاقات الخلوية
لمزيد من التأكيد على فرضية أن التغيير في صلابة الركيزة يؤثر على التصاق NCC ، تم قياس التغيرات في تعبير Vcl كميا عبر RT-qPCR في NCCs استجابة لمستويات صلابة الهيدروجيل المختلفة. VCL هي واحدة من العديد من البروتينات الهيكل الخلوي الموجودة في مجمع الالتصاق البؤري خلال عملية الخلية إقامة اتصالات مع الركيزة واستشعار خصائص ECM32. الالتصاقات البؤرية هي نقاط الاتصال للخلايا إلى ECM عبر مستقبلات integrin ، والتي ترسو على الهيكل الخلوي actin السيتوبلازمي ، F-actin33 يشير مستوى التعبير الجيني VCL إلى التغيرات في الالتصاقات البؤرية والتصاقات الخلايا لخلايا O9-1 استجابة لتصلب الركيزة.
أظهرت الدراسات السابقة تأثير Vcl على التصاق الخلايا في الخلايا الجذعية الجنينية والخلايا الليفية عن طريق الاختلافات في التعبير عنها. ردا على التعبير العالي عن VCL، زاد عدد وأحجام الالتصاقات البؤرية أيضا ولكن انخفض عندما تم إسقاط Vcl 34. باستمرار، أظهرت خلايا VCLناقصة أيضا انخفاضا كبيرا في الالتصاق الخلية وانتشار35. بالإضافة إلى ذلك، VCL يلعب دورا في تنظيم الالتصاق الخلية من خلال تحقيق الاستقرار الالتصاقات البؤرية36. حجم الالتصاقات البؤرية، ومستوى النضج، والتراكيب تختلف وفقا لتيبس الركيزة، مما يسمح للإشارات التي يتم نقلها داخل الخلايا والخلايا للرد على الإشارات البيئية37. وهكذا، يتم تجنيد VCL للغاية لمجمعات الالتصاق البؤري في الخلايا التي تزرع على ركائز قاسية، كما ينعكس من خلال مستويات الحمض النووي الريبي أعلى الكشف عنها من قبل RT-qPCR (الشكل 6C).
الخلايا التي تزرع على ركائز أكثر ليونة تشكل الحد الأدنى من مجمعات الالتصاق البؤري، كما ينعكس في انخفاض مستويات الحمض النووي الريبي من VCL في الخلايا15. في الشكل 6C، أظهرت خلايا O9-1 تعبيرا أعلى عن Vcl على الركيزة الصلبة من الركيزة الناعمة. تشير هذه النتائج إلى مستوى أعلى من الالتصاقات الركيزة للخلايا O9-1 على ركائز قاسية من خلايا O9-1 على ركائز أكثر ليونة. بالإضافة إلى ذلك ، تم تصور تعبير Vcl نوعيا من خلال تلطيخ IF بأجسام مضادة Vcl لمواصلة استكمال ودعم اكتشاف RT-qPCR. باستمرار، كان التعبير VCL في الخلايا O9-1 نمت على الركيزة أكثر صلابة أعلى من تلك التي نمت على الركيزة ليونة(الشكل 6A،B)،والتي دعمت كذلك النتيجة الأولية للالتصاق الخلية عالية وتنتشر على هيدروجيل 40 كيلو باسكال بالمقارنة مع هيدروجيل 1 كابا لوحظ مع F-actin phalloidin تلطيخ ومستويات التعبير VCL عبر RT-qPCR.
الشكل 1:منحنيات القوة المتولدة من المسافة البادئة للمسبار AFM. تشير القوة (المحور ص) إلى القوة المطلوبة المطبقة في nN، ويشير Z (المحور x) إلى مسافة مسبار Bruker AFM من العينة في μm. ل1 كيلو باسكال هيدروجيل (A), المنحدر المتولد هو لطيف مقابل المنحدر أكثر انحدارا لوحظ ل40 كيلو باسكال هيدروجيل (ب). تمثل المنحنيات الملونة حركة الكاستيليفر على مسبار AFM عند اقترابه (الأزرق) وتراجعه (الأحمر) من عينة الهيدروجيل. تشير أعلى نقطة بداية للمنحنى إلى الاتصال الجامد للزلاق الزجاجي. (ب)يشير الانخفاض الكبير في المنحنى المتراجع في هيدروجيل 40 كيلو باسكال إلى التصاق بين الخرزة والعينة. اختصار: AFM = المجهر القوة الذرية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2:متوسط صلابة الهيدروجيلات (بالكيلوباسكال) المحسوبة من معامل الشباب المرن. تم إنشاء معامل الشباب من منحنيات القوة من الشكل 1. وكانت معامل مرونة المشار إليها من الهيدروجيلات 0.5 كيلو باسكال، 1 كيلو باسكال، 10 كيلو باسكال، 20 كيلو باسكال، و 40 كيلو باسكال. تشير أشرطة الخطأ إلى الانحراف المعياري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3:صور ذات مجال مشرق لخلايا P19 و O9-1 مطلية على 1 كيلو باسكال و 40 كيلو باسكال هيدروجيلس للتحكم وأنظمة هلام معدلة للكشف عن خصائص نمو الخلايا. (A-D) P19 و (E-H) O9-1 الخلايا؛ ويشار إلى الخلايا الميتة من قبل السهام الحمراء. أشرطة المقياس = 25 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: Immunofluorescence تلطيخ علامة NCC AP-2 في O9-1 NCCs لتصور التوافق NCC. (A) A 40 كيلو باسكال تعديل نظام الهيدروجيل مقارنة مع (B) مراقبة 40 كيلو باسكال. AP-2 (أخضر); كانت ملطخة nuclei مع DAPI (الأزرق). أشرطة المقياس = 25 ميكرومتر (C) يوفر الرسم البياني الشريطي قياسا كميا لمستوى التعبير AP-2 الذي يظهر الأهمية(p-value = 0.003) (n = 3). تظهر البيانات التعبير النسبي مع أشرطة الخطأ الانحراف المعياري المتوفرة. المختصرات: NCC = خلية القمة العصبية; DAPI = 4′,6-دياميدينو-2-فينيليندول. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تلطيخ phalloidin الفلورسنت من F-أكتين تظهر ألياف الإجهاد التي تنتشر بشكل جيد في خلايا O9-1 على هيدروجيل 40 كيلو باسكال. تم استزراع خلايا O9-1 على 1 كيلو باسكال (A) و 40 كيلو باسكال هيدروجيلس (B). كانت خلايا O9-1 ملطخة باستخدام أليكسا فلور 488 فالويدين (أخضر) ، وكانت النوى ملطخة DAPI (الأزرق). أشرطة المقياس = 25 ميكرومتر. اختصار: DAPI = 4′,6-دياميدينو-2-فينيليندول. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: صور immunofluorescence من vinculin في خلايا O9-1. كانت مطلية O9-1 الخلايا على 1 كيلو باسكال (أ) و 40 كيلو باسكال (ب) هيدروجيلس. كانت النوى ملطخة DAPI (الأزرق). أشرطة المقياس = 25 ميكرومتر (C) تحليل PCR الكمي في الوقت الحقيقي من إجمالي مستوى مرنا من VCL في خلايا O9-1 المستزرعة على 1 كيلو باسكال و 40 كيلو باسكال هيدروجيلس. VCL مستوى التعبير على هيدروجيل 1 كيلو باسكال أقل بكثير من ذلك على هيدروجيل 40 كيلو باسكال(ع-قيمة = 0.02). تظهر البيانات المتوسط مع أشرطة أخطاء الانحراف المعياري المتوفرة. اختصار: DAPI = 4′,6-دياميدينو-2-فينيليندول. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| 500 ميكرولتر الحجم الإجمالي | 0.5 كيلو باسكال | 1 كيلو باسكال | 10 كيلو باسكال | 20 كيلو باسكال | 40 كيلو باسكال | ||
| 40٪ أكريلاميد (ميكرولتر) | 37.5 | 62.5 | 125 | 100 | 100 | ||
| 20٪ بيس أكريلاميد (ميكرولتر) | 15 | 7.5 | 25 | 66 | 120 | ||
| H2O (ميكرولتر) | 447.5 | 430 | 350 | 334 | 280 | ||
| 10٪ وكالة الأنباء الجزائرية (ميكرولتر) | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | ||
| تيماد (ميكرولتر) | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | ||
الجدول 1: أحجام المقابلة من الحلول للحصول على مستويات صلابة المطلوب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
والهدف من الدراسة الحالية هو توفير نظام فعال وفعال في المختبر لفهم تأثير الإشارات الميكانيكية في المركبات غير السارية فهما أفضل. بالإضافة إلى اتباع البروتوكول خطوة بخطوة المذكورة أعلاه، يحتاج الباحثون إلى أن نضع في اعتبارنا أن ثقافة الخلية من O9-1 NCCs تتأثر بنوع من الأغطية الزجاجية المستخدمة لإعداد الهيدروجيل. فعلى سبيل المثال، لوحظ أن الخلايا المصنفة على نوع معين من الأغطية الزجاجية (انظر جدول المواد)نجت وانتشرت بشكل جيد، في حين أظهرت الخلايا المستزرعة المصنفة على أنواع أخرى من الأغطية الزجاجية المزيد من موت الخلايا. وعلاوة على ذلك، من المهم أن تتبع بدقة ظروف ثقافة الخلية الصحيحة لO9-1 NCCs38. نوعية ثقافة الخلية هو الأمثل عندما يتم استخدام الهيدروجيلات في أقرب وقت ممكن أو تخزينها في حاضنة 37 درجة مئوية معقمة لمدة تصل إلى يومين.
ونظرا لحساسية كل مكون في البروتوكول، يمكن أن يختلف معامل المرونة عبر التجارب. بالإضافة إلى النقاط المذكورة في البروتوكول (الخطوة 1.3.2) فيما يتعلق ب 10٪ من APS، تؤثر العوامل الحرجة الأخرى التي يجب وضعها في الاعتبار أيضا على الاختلاف. وثمة عامل آخر اشتبه في أنه تسبب في اختلافات كبيرة في قياسات AFM هو سمك الهيدروجيلات. وكانت دراسة سابقة قد حققت في تأثير سمك على مودولي يونغ، تتراوح بين 15 إلى 1000 ميكرومتر، ووجدت أن الاختلافات في سمك لم يغير مودولي الشباب بشكل كبير39. ومع ذلك ، فإن سمك الركائز يؤثر أيضا على الخصائص الميكانيكية التي يمكن للخلايا الشعور بها ، مما يؤدي إلى مورفولوجيا مختلفة40،41،42. وأظهرت دراسات مختلفة أن زيادة كبيرة في سمك الهيدروجيلات أدت إلى انخفاض في منطقة الخلية، وانتشار، وتصلب فعال منالهيدروجيلس 40،41،42. ومع ذلك ، فإن الأنماط الظاهرية للخلايا تتغير أيضا استجابة للهيدروجيلات الرقيقة بشكل ملحوظ ، على سبيل المثال ، انتشار أعلى حتى على الهيدروجيلات منخفضة التصلب40،41،42. مع حجم ثابت من المواد الهلامية البولي أكريلاميد، وسمك الهيدروجيلات ينبغي أن تكون موحدة بحيث انحرافات طفيفة لن تؤثر بشكل كبير على المغير مرنة في قياسات AFM.
فمن الأفضل لتعقيم coverlips عن طريق تمريرها ذهابا وإيابا في اللهب باستخدام الموقد الكحول لأن أساليب التعقيم الأخرى يمكن أن تكون أكثر تعقيدا وتسبب ضررا محتملا للأغطية الزجاج. يمكن استخدام أحجام مختلفة من الأغطية الزجاجية بناء على المتطلبات التجريبية. استخدم هذا البروتوكول أغطية 12 مم و25 مم للكيمياء المناعية وRT-qPCR على التوالي. استخدام المواد الهلامية المناسبة الحجم لتناسب التجارب يشجع على الكفاءة ويقلل من النفايات. تم التحقق من صحة هذه التعديلات نوعيا وكميا لضمان التحسين ل O9-1 NCCs مقارنة بنظام الهيدروجيل الأصلي (التحكم)20. تم تقييم الصحة العامة ونمو المركبات غير السارية O9-1 تحت مجهر مشرق لخصائص المرفق الخلوي والركيزي.
بالإضافة إلى ذلك، تمت مقارنة توافق خلايا O9-1 بين كل من التحكم وأنظمة الهيدروجيل المعدلة لزيادة التحقق من صحة التعديلات في هذا البروتوكول من خلال تصور نوعيا التعبير AP-2 باستخدام تلطيخ IF. تم تحديد كثافة الإشارات كميا لزيادة دعم الصور التمثيلية لتعبير AP-2 في خلايا O9-1 بين التحكم مقابل أنظمة الهيدروجيل المعدلة. في حين أن AP-2 هو علامة NCC شائعة ، يجب النظر في علامات أخرى معروفة للتحقق من الصحة ، مثل Sox10 و Pax3 ، نظرا لأهميتها للحفاظ على NCC للبلوريبوتينسي والبقاء على قيد الحياة28. بالإضافة إلى ذلك، تم تأكيد التحسين في هذا البروتوكول من خلال مقارنة خلايا O9-1 NC مع خط خلية آخر، P19، لضمان أن نظام الهيدروجيل هذا فعال وموثوق به لخلايا NC. على الرغم من أن خلايا P19 لها خصائص خالدة ويتم استزراعها بسهولة ، إلا أنها لم تزدهر بشكل جيد على أي من أنظمة الهيدروجيل.
غالبا ما يتم التعبير عن مقاومة القوة الممدودة الناتجة عن صلابة الركيزة أو الأنسجة حيث ترتبط الخلايا كمعامل مرن يونغ45. مع AFM، يتم الحصول على معامل الشباب مرنة من منحنى القوة المتولدة من القوة العمودية المطبقة26. يمكن أن تحدث اختلافات كبيرة أثناء قياس AFM ، بين القياسات التي يمكن أن تؤدي إلى قراءات غير دقيقة للهيدروجلز الأكثر صلابة. يمكن أن يكون سبب عدم الاتساق من قبل تحقيقات غير لائقة تستخدم للقياس. فعلى سبيل المثال، يتطلب قياس 20 كيلو باسكال و40 كيلو باسكال هيدروجيلس استخدام مسبار أكثر صلابة مع ثابت ربيعي أعلى (k = 0.24 N/m). مسبار أكثر صلابة يسمح لقرار أقل بالمقارنة مع ليونة التحقيق; ومع ذلك، هناك أسباب لصالح اختيار التحقيق أكثر صلابة كما cantilevers لينة جدا يمكن أن تلتزمالعينات 46. وبالإضافة إلى ذلك، مسابير لينة جدا حساسة للغاية، مما يسهم في إشارات كاذبة من الجسيمات غير المرغوب فيها، ويؤدي إلى انخفاض مصطنع أو أعلى قيم صلابة من صلابة حقيقية46. وعلاوة على ذلك، يجب ملاحظة المدخلات الدقيقة لنسبة بواسون، اعتمادا على مواد القياس؛ ويمكن العثور على ذلك في الدراسات الموحدة لأن هذا يؤثر بشكل كبير على ناتج البيانات.
بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام AFM لقياس سمك الهيدروجيلات ، حيث أن السماكة هي خاصية ميكانيكية أخرى تؤثر على كيفية إحساس الخلايا ببيئتهم47،42. في مختلف الدراسات المبلغ عنها، لوحظ أن الخلايا التي تزرع على الهيدروجيلات الناعمة مستديرة الشكل عند "سمك حرج" وتتجاوزه، والتي يتم الإبلاغ عنها عند ~2-5 ميكرومتر، اعتمادا على نوع الخلية47و42و48. ومع ذلك ، لوحظ انتشار أعلى بكثير عندما كانت مطلية الخلايا على الهيدروجيلات من صلابة نفسه ولكن سمك أقل من "سمك الحرجة"42،48. تفسير محتمل لهذه النتيجة المثيرة للاهتمام هو أن سمك هيدروجيلس دون الحرجة تمكن الخلايا من الشعور بالأغطية الزجاجية الأساسية الصلبة حيث تمارس الخلايا الجر للإزاحة الجانبية47. وكان متوسط سمك عبر hydrogels جميع تصلب 342 ميكرومتر مع انحراف معياري قدره 27 ميكرومتر. سمك الهيدروجيلات كان أعلى من "سمك الحرجة" المقترحة، وضمن نطاق الاختبار من أقل من 400 ميكرومتر، والتي تم الإبلاغ عنها في الدراسات والهيدروجلز المصنعة مسبقا، بحيث يمكن للخلايا الشعور صلابة مختلفة من الهيدروجيل وليس الزجاج الصلبة الكامنة coverslips42،48.
بالإضافة إلى طريقة التحليل الكمي AFM ، تم أيضا تحليل الهيدروجيلات نوعيا من خلال الكيمياء المناعية لدراسة التعبير عن العلامات المتأثرة بالتصلب المتفاوت في خلايا O9-1 وتصور النمو الصحي للخلايا. يرتبط F-actin في السيتوبلازم إلى integrins الغشاء ملزمة عن طريق مجموعة من البروتينات الهيكل الخلوي, مثل تالين وVCL, تشكيل مجمع الالتصاق البؤري33. كما يمكن تحليل التعبير عن ألياف الإجهاد في الخلايا من خلال قياس التعبير عن الجينات الهيكل الخلوي الأخرى في الخلايا، مثل تالين وإنتيغرين، والتي يمكن تصورها معا باستخدام مجموعة تلطيخ الالتصاق البؤري.
كانت هناك درجات متفاوتة من تصلب الهيدروجيل التي أثرت على مورفولوجيا NCC والاستجابة، كما رأينا في التغيير في التصاق الخلايا وألياف الإجهاد من خلال الإشارات الميكانيكية. يوفر هذا البروتوكول القدرة على التأثير على تمايز الخلايا في أنواع مختلفة من الخلايا عن طريق تعديل ظروف الثقافة المقابلة في المختبر، وبالتالي توفير طريقة مريحة للتلاعب بالإشارات الميكانيكية والإشارات الكيميائية في NCCs. كما ذكر سابقا، ومصير التمايز NCC تسترشد إلى حد كبير من قبل القوى الميكانيكية الموجودة في الأنسجة المحيطة بها، بما في ذلك صلابة2،3. وفي حين أن الهدف المباشر لهذه الورقة هو وضع بروتوكول تدريجي لإعداد الهيدروجيلات لثقافة المركبات المكلورة الوطنية، فإن الفوائد المحتملة لهذا البروتوكول تتجاوز المنهجية، والسعي إلى زيادة المعرفة بالإشارة الميكانيكية في البلدان غير الحكومية. وتجدر الإشارة أيضا إلى أن هذا النظام في المختبر له بعض القيود. هذه التقنية من تصنيع الهيدروجيلات تضم خطوات متعددة يمكن أن تؤدي إلى اختلافات تقنية على طول الطريق ، بما في ذلك التغايرية ، والسطح غير المستوي ، وتصلب غير دقيق. لذلك، يجب على المستخدمين تنفيذ هذه الخطوات بعناية لتقليل الاختلافات التقنية أثناء التجارب. بالإضافة إلى ذلك ، فإن المواد الهلامية البولي أكريلاميد في هذا النظام تقتصر على الدراسات 2D الثقافة بسبب سمية الأكريلاميد ، متجاهلا البيئة البيولوجية 3D الدقيقة التي تسكن NCCs50.
وعلى الرغم من هذه القيود، فإن هذا النظام في المختبر يسمح بطريقة غير مكلفة وبسيطة تفيد جميع مستويات البحث وتمكن الباحثين من إجراء اختبارات كافية وعملية في المصب. كما رأينا في النتائج الأخيرة، تعتمد NCCs بشكل كبير على كل من الإشارات الميكانيكية، مثل قوة القص وتصلب الركيزة، والإشارات الكيميائية، مثل Wnt وإشارة عامل نمو الخلايا الليفية، في القحف، وكذلك نمو القلب في الفقاريات6،15. وباستخدام هذا البروتوكول، يمكن محاكاة البيئات الدقيقة المحلية للتجارب المختبرية بسهولة للدراسات المستقبلية حول الأمراض غير السارية، بما في ذلك التمايز والهجرة والاستجابات الخلوية وإمكانية تطور الأمراض الضارة. ولذلك، فإن هذا النظام في المختبر سيكون أداة قوية لدراسة أدوار الإشارات الميكانيكية في اللجان الوطنية وتفاعلاتها مع مسارات الإشارات الأخرى، مما سيعمق فهم الآليات الجزيئية والجينية لتطوير NCC والأمراض ذات الصلة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يوجد لدى صاحبي البلاغ تضارب في المصالح يكشفان عنه.
Acknowledgments
نشكر الدكتورة آنا ماريا زاسكي، مشغلة منشأة المجهر-UT Core التابعة للقوة الذرية في مركز العلوم الصحية بجامعة تكساس، على الخبرة المساهمة في AFM في هذا المشروع. كما نشكر مصادر التمويل من المعاهد الوطنية للصحة (K01DE026561، R03DE025873، R01DE029014، R56HL142704، وR01HL142704 إلى J. Wang).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip | Chemglass Life Sciences | CLS-1763-012 | |
| 2% Bis-Acrylamide | Sigma Aldrich | M1533 | |
| 24-well plate | Greiner Bio-one | 662165 | |
| 25 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip | Chemglass Life Sciences | CLS-1763-025 | |
| 3-aminopropyl triethoxysilane (APTS) | Sigma Aldrich | A3648 | |
| 4-well cell culture plate | Thermo Scientific | 179830 | |
| 4% Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | J61899-AP | |
| 40% Acrylamide | Sigma Aldrich | A4058 | |
| 50% glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G7651 | |
| 6-well cell culture plate | Greiner Bio-one | 657160 | |
| AFM cantilever (spherical bead) | Novascan | ||
| AFM software | Catalyst NanoScope | Model: 8.15 SR3R1 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher | A12379 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Sigma Aldrich | 248614 | Powder |
| anti-AP-2α Antibody | Santa Cruz | sc-12726 | |
| anti-Vinculin antibody | Abcam | ab129002 | |
| Atomic Force Microscopy (AFM) Bioscope Catalyst | Bruker Corporation | ||
| Collagen type I (100mg) | Corning | 354236 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher | D1306 | |
| Dichloromethylsilane (DCMS) | Sigma Aldrich | 440272 | |
| Donkey serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10-017-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Fluorescence microscope | Leica | Model DMi8 | |
| Fluoromount-G mounting medium | SouthernBiotech | 0100-35 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | Powder |
| Horse serum | Corning | 35-030-CI | |
| iScript Reverse Transcription Supermix | Bio-Rad | 1708841 | |
| Penicillin-Streptomycin antibiotic | Thermo Fisher | 15140148 | |
| RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
| Sterile 1x PBS | Hyclone | SH30256.02 | |
| Sterile deionized water | Hardy Diagnostics | U284 | |
| sulfo-SANPAH | Thermo Fisher | 22589 | |
| SYBR green | Applied Biosystems | 4472908 | |
| TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 |
References
- Mehrotra, P., Tseropoulos, G., Bronner, M. E., Andreadis, S. T. Adult tissue-derived neural crest-like stem cells: Sources, regulatory networks, and translational potential. Stem Cells Translational Medicine. 9 (3), 328-341 (2020).
- Liu, J. A., Cheung, M. Neural crest stem cells and their potential therapeutic applications. Developmental Biology. 419 (2), 199-216 (2016).
- Watt, K. E. N., Trainor, P. A. Neurocristopathies: the etiology and pathogenesis of disorders arising from defects in neural crest cell development. Neural Crest Cells-Evolution, Development and Disease. Trainor, P. A. , Academic Press. 361-394 (2014).
- Lavelle, C. L. B. Applied oral physiology. , Butterworth-Heinemann. (1988).
- Chin, L. The genetics of malignant melanoma: lessons from mouse and man. Nature Reviews Cancer. 3 (8), 559-570 (2003).
- Hindley, C. J., et al. The Hippo pathway member YAP enhances human neural crest cell fate and migration. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
- Wang, Q., et al. Perturbed development of cranial neural crest cells in association with reduced sonic hedgehog signaling underlies the pathogenesis of retinoic-acid-induced cleft palate. Disease Models & Mechanisms. 12 (10), (2019).
- Rocha, M., Singh, N., Ahsan, K., Beiriger, A., Prince, V. E. Neural crest development: insights from the zebrafish. Developmental Dynamics. 249 (1), 88-111 (2020).
- Barriga, E. H., Franze, K., Charras, G., Mayor, R. Tissue stiffening coordinates morphogenesis by triggering collective cell migration in vivo. Nature. 554 (7693), 523-527 (2018).
- Weber, G. F., Bjerke, M. A., DeSimone, D. W. A mechanoresponsive cadherin-keratin complex directs polarized protrusive behavior and collective cell migration. Developmental Cell. 22 (1), 104-115 (2012).
- Mason, D. E., et al. YAP and TAZ limit cytoskeletal and focal adhesion maturation to enable persistent cell motility. Journal of Cell Biology. 218 (4), 1369-1389 (2019).
- Dupont, S., et al.
- Lu, Y. -B., et al. Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (47), 17759-17764 (2006).
- Georges, P. C., Miller, W. J., Meaney, D. F., Sawyer, E. S., Janmey, P. A. Matrices with compliance comparable to that of brain tissue select neuronal over glial growth in mixed cortical cultures. Biophysical Journal. 90 (8), 3012-3018 (2006).
- Janmey, P. A., Miller, R. T. Mechanisms of mechanical signaling in development and disease. Journal of Cell Science. 124 (1), 9-18 (2011).
- Engler, A., Sweeney, H., Discher, D., Schwarzbauer, J. E. Extracellular matrix elasticity directs stem cell differentiation. Journal of Musculoskeletal and Neuronal Interactions. 7 (4), 335 (2007).
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
- Engler, A. J., et al. Embryonic cardiomyocytes beat best on a matrix with heart-like elasticity: scar-like rigidity inhibits beating. Journal of Cell Science. 121 (22), 3794-3802 (2008).
- Robling, A. G., Turner, C. H. Mechanical signaling for bone modeling and remodeling. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 19 (4), 319-338 (2009).
- Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 10, Unit 10.16 (2010).
- Cretu, A., Castagnino, P., Assoian, R. Studying the effects of matrix stiffness on cellular function using acrylamide-based hydrogels. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (42), e2089 (2010).
- Ishii, M., et al. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).
- Engler, A., et al. Substrate compliance versus ligand density in cell on gel responses. Biophysical Journal. 86 (1), 617-628 (2004).
- Stanton, A. E., Tong, X., Yang, F. Varying solvent type modulates collagen coating and stem cell mechanotransduction on hydrogel substrates. APL Bioengineering. 3 (3), 036108 (2019).
- Fedoroff, S., Hall, C. Effect of horse serum on neural cell differentiation in tissue culture. In vitro. 15 (8), 641-648 (1979).
- Huth, S., Sindt, S., Selhuber-Unkel, C. Automated analysis of soft hydrogel microindentation: Impact of various indentation parameters on the measurement of Young's modulus. PLoS One. 14 (8), 0220281 (2019).
- Mitchell, P. J., Timmons, P. M., Hébert, J. M., Rigby, P., Tjian, R. Transcription factor AP-2 is expressed in neural crest cell lineages during mouse embryogenesis. Genes & Development. 5 (1), 105-119 (1991).
- Wegner, M. Neural crest diversification and specification: transcriptional control of Schwann Cell differentiation. Encyclopedia of Neuroscience. , 153-158 (2010).
- Park, J. S., et al. The effect of matrix stiffness on the differentiation of mesenchymal stem cells in response to TGF-β. Biomaterials. 32 (16), 3921-3930 (2011).
- Sun, M., et al. Effects of matrix stiffness on the morphology, adhesion, proliferation and osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells. International Journal of Medical Sciences. 15 (3), 257 (2018).
- Burridge, K., Guilluy, C. Focal adhesions, stress fibers and mechanical tension. Experimental Cell Research. 343 (1), 14-20 (2016).
- Burridge, K. Focal adhesions: a personal perspective on a half century of progress. The FEBS Journal. 284 (20), 3355-3361 (2017).
- Zhou, C., et al. Compliant substratum modulates vinculin expression in focal adhesion plaques in skeletal cells. International Journal of Oral Science. 11 (2), 1-9 (2019).
- Fernández, J. L. R., Geiger, B., Salomon, D., Ben-Ze'ev, A. Overexpression of vinculin suppresses cell motility in BALB/c 3T3 cells. Cell Motility and the Cytoskeleton. 22 (2), 127-134 (1992).
- Coll, J., et al. Targeted disruption of vinculin genes in F9 and embryonic stem cells changes cell morphology, adhesion, and locomotion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (20), 9161-9165 (1995).
- Saunders, R. M., et al. Role of vinculin in regulating focal adhesion turnover. European Journal of Cell Biology. 85 (6), 487-500 (2006).
- Kuo, J. -C. Focal adhesions function as a mechanosensor. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 126, 55-73 (2014).
- Nguyen, B. H., Ishii, M., Maxson, R. E., Wang, J. Culturing and manipulation of O9-1 neural crest cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58346 (2018).
- Kolewe, K. W., Zhu, J., Mako, N. R., Nonnenmann, S. S., Schiffman, J. D. Bacterial adhesion is affected by the thickness and stiffness of poly (ethylene glycol) hydrogels. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (3), 2275-2281 (2018).
- Lin, Y. -C., et al.
- Mullen, C. A., Vaughan, T. J., Billiar, K. L., McNamara, L. M. The effect of substrate stiffness, thickness, and cross-linking density on osteogenic cell behavior. Biophysical Journal. 108 (7), 1604-1612 (2015).
- Tusan, C. G., et al. Collective cell behavior in mechanosensing of substrate thickness. Biophysical Journal. 114 (11), 2743-2755 (2018).
- McBurney, M. W., Jones-Villeneuve, E. M., Edwards, M. K., Anderson, P. J. Control of muscle and neuronal differentiation in a cultured embryonal carcinoma cell line. Nature. 299 (5879), 165-167 (1982).
- Hasegawa, A., Shirayoshi, Y. P19 cells overexpressing Lhx1 differentiate into the definitive endoderm by recapitulating an embryonic developmental pathway. Yonago Acta Medica. 58 (1), 15 (2015).
- Wells, R. G.
- Gavara, N. A beginner's guide to atomic force microscopy probing for cell mechanics. Microscopy Research and Technique. 80 (1), 75-84 (2017).
- Butler, J. P., Tolic-Nørrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).
- Leong, W. S., et al. Thickness sensing of hMSCs on collagen gel directs stem cell fate. Biochemical and Biophysical Research Communications. 401 (2), 287-292 (2010).
- Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
- Funaki, M., Janmey, P. A. Technologies to engineer cell substrate mechanics in hydrogels. Biology and Engineering of Stem Cell Niches. , Academic Press. 363-373 (2017).
