Gewebeentnahme und RNA-Extraktion aus dem humanen osteoarthritischen Kniegelenk

Summary

Primärgewebe, die von Patienten nach einer totalen Knieendoprothetik gewonnen werden, bieten ein experimentelles Modell für die Arthroseforschung mit maximaler klinischer Translatierbarkeit. Dieses Protokoll beschreibt, wie RNA aus sieben einzigartigen Kniegeweben identifiziert, verarbeitet und isoliert werden kann, um die mechanistische Untersuchung bei menschlicher Osteoarthritis zu unterstützen.

Abstract

Osteoarthritis (OA) ist eine chronische und degenerative Gelenkerkrankung, die am häufigsten das Knie betrifft. Da es derzeit keine Heilung gibt, ist die totale Knieendoprothetik (TKA) ein häufiger chirurgischer Eingriff. Experimente mit primären menschlichen OA-Geweben, die aus TKA gewonnen wurden, bieten die Möglichkeit, Krankheitsmechanismen ex vivozu untersuchen. Während früher angenommen wurde, dass OA hauptsächlich den Knorpel beeinflusst, ist heute bekannt, dass es mehrere Gewebe im Gelenk beeinflusst. Dieses Protokoll beschreibt die Patientenauswahl, Probenverarbeitung, Gewebehomogenisierung, RNA-Extraktion und Qualitätskontrolle (basierend auf RNA-Reinheit, Integrität und Ausbeute) aus jedem der sieben einzigartigen Gewebe, um die Untersuchung des Krankheitsmechanismus im Kniegelenk zu unterstützen. Mit Einverständniserklärung wurden Proben von Patienten entnommen, die sich einer TKA für OA unterzogen. Gewebe wurden innerhalb von 4 Stunden nach der Operation durch Schockgefrieren zur RNA- oder Formalinfixierung für die Histologie seziert, gewaschen und gelagert. Zu den gesammelten Geweben gehörten Gelenkknorpel, subchondraler Knochen, Meniskus, infrapatellares Fettpolster, vorderes Kreuzband, Synovium und Vastus medialis schräger Muskel. RNA-Extraktionsprotokolle wurden für jeden Gewebetyp getestet. Die bedeutendste Modifikation betraf die Methode des Zerfalls, die für niedrigzellige, hochmatrixreiche Hartgewebe (als Knorpel, Knochen und Meniskus betrachtet) im Vergleich zu relativ hochzelligen, niedrigmatrixigen Weichteilen (als Fettpolster, Band, Synovium und Muskel betrachtet) verwendet wurde. Es wurde festgestellt, dass die Pulverisierung für Hartgewebe und die Homogenisierung für Weichteile geeignet war. Es wurde eine Neigung für einige Probanden beobachtet, höhere RNA-Integritätszahlwerte (RIN) als andere Probanden konsistent über mehrere Gewebe hinweg zu liefern, was darauf hindeutet, dass zugrunde liegende Faktoren wie der Schweregrad der Erkrankung die RNA-Qualität beeinflussen können. Die Fähigkeit, hochwertige RNA aus primären menschlichen OA-Geweben zu isolieren, bietet ein physiologisch relevantes Modell für anspruchsvolle Genexpressionsexperimente, einschließlich Sequenzierung, die zu klinischen Erkenntnissen führen können, die leichter auf Patienten übertragen werden können.

Introduction

Das Knie ist das größte Synovialgelenk im menschlichen Körper, bestehend aus dem tibiofemoralen Gelenk zwischen Tibia und Femur und dem Patellofemoralgelenk zwischen Patella und Femur¹. Die Knochen im Knie sind mit Gelenkknorpel ausgekleidet und werden von verschiedenen Bindegeweben unterstützt, einschließlich Menisken, Fett, Bändern und Muskeln, und eine Synovialmembran umschließt das gesamte Gelenk, um eine mit Synovialflüssigkeit gefüllte Höhle zu bilden^1,2,3 ( Abbildung1). Ein gesundes Knie fungiert als bewegliches Scharniergelenk, das eine reibungsfreie Bewegung in der Frontalebene^{ermöglicht 1,3}. Unter pathologischen Bedingungen kann die Bewegung eingeschränkt und schmerzhaft werden. Die häufigste degenerative Erkrankung des Kniegelenks ist die Arthrose (OA)⁴. Es ist bekannt, dass eine Vielzahl von Risikofaktoren für die Entwicklung von OA prädisponieren, darunter höheres Alter, Fettleibigkeit, weibliches Geschlecht, Gelenktraumata und Genetik, unter anderem^5,6. Derzeit gibt es in den USA schätzungsweise 14 Millionen Menschen mit symptomatischer Knie-OA, wobei die Prävalenz aufgrund des steigenden Bevölkerungsalters und der Fettleibigkeitsraten zunimmt^7,8. Anfangs als Knorpelerkrankung betrachtet, wird OA heute als Erkrankung des gesamten Gelenks verstanden⁹. Häufig beobachtete pathologische Veränderungen bei OA umfassen Gelenkknorpelerosion, Osteophytenbildung, subchondrale Knochenverdickung und Entzündung der Synovia^9,10. Da es keine bekannte Heilung für OA gibt, konzentrieren sich die Behandlungen in erster Linie auf die Symptombehandlung (z. B. Schmerz)^11,12, und sobald OA in das Endstadium fortgeschritten ist, ist eine Gelenkersatzoperation oft indiziert¹³.

Gelenkersatzoperationen können entweder teilweise oder totaler Knieersatz sein, wobei die totale Knieendoprothetik (TKA) den Ersatz der gesamten tibiofemoralen Artikulation und des patellofemoralen Gelenks umfasst. Ab 2020 werden in den USA jedes Jahr ca. 1 Million TKAs durchgeführt¹⁴. Während der TKA reseziert ein orthopädischer Chirurg den oberen Teil des Tibiaplateaus und die unteren Femurkondylen (Abbildung 2A, 2B), um mit prothetischen Implantaten ausgestattet zu werden. Manchmal von Patienten falsch interpretiert, werden in einem TKA nur 8-10 mm vom Ende jedes Knochens reseziert, der anschließend mit Metall verschlossen oder wieder aufgetaucht wird. Ein dazwischenliegender Polyethylen-Liner bildet die Auflagefläche (d.h. Polsterung) zwischen den beiden Metallimplantaten. Darüber hinaus werden mehrere Weichteilkomponenten des Gelenks ganz oder teilweise ausgeschnitten, um ein angemessenes Gelenkgleichgewicht zu erreichen. Zu diesen Geweben gehören die mediale und laterale Menisken (Abbildung 2C), das infrapatellare Fettpolster (Abbildung 2D), das vordere Kreuzband (ACL; Abbildung 2E), Synovium (Abbildung 2F) und Vastus medialis schräger Muskel (VMO; Abbildung 2G) ^15.Obwohl TKAs im Allgemeinen erfolgreich für die OA-Behandlung sind, berichten etwa 20% der Patienten von einem Wiederauftreten von Schmerzen nach der Operation^16. Zusammen mit den hohen Kosten und der relativen Invasivität des Verfahrens weisen diese Einschränkungen auf die Notwendigkeit weiterer Forschung hin, um alternative Behandlungen zu identifizieren, um das Fortschreiten von OA zu mildern.

Um Krankheitsmechanismen bei OA zu erforschen, die neue Wege für therapeutische Interventionen eröffnen können, können experimentelle Systeme, einschließlich Zellen, Gewebeexplantaten und Tiermodelle, verwendet werden. Zellen werden typischerweise in Monoschicht kultiviert und stammen aus primären menschlichen oder tierischen Geweben (z. B. aus Knorpel isolierte Chondrozyten) oder immortalisierten Zellen (z. B. ATDC5¹⁷ und CHON-001^18). Während Zellen für die Manipulation experimenteller Variablen in einer kontrollierten Kulturumgebung nützlich sein können, erfassen sie keine Bedingungen des natürlichen Gelenks, von denen bekannt ist, dass sie die Zellphänotypen^{beeinflussen 19}. Um die komplexe Kaskade der chemischen, mechanischen und Zell-zu-Zell-Kommunikation, die OA zugrunde liegt, besser zu rekapitulieren, wird eine Alternative in primären menschlichen oder tierischen Gewebeproben gefunden, unabhängig davon, ob sie frisch oder ex vivo als Explantaten kultiviert werden, um die Gewebestruktur und die Zellmikroumgebung zu erhalten²⁰. Um das Gelenk in vivozu untersuchen, sind auch kleine (z. B. Maus²¹⁾und große (z. B. Pferd²²⁾Tiermodelle für OA (z. B. durch chirurgische Induktion, genetische Veränderung oder Alterung) nützlich. Die Translation von diesen Modellen auf menschliche Krankheiten kann jedoch durch anatomische, physiologische und metabolische Unterschiede begrenzt werden, unter anderem²³. In Anbetracht der Vor- und Nachteile experimenteller Systeme maximieren die Hauptstärken der Spezies-Spezifischen und der Aufrechterhaltung der extrazellulären Nische, die das primäre menschliche OA-Gewebe bietet, das translationale Potenzial der Forschungsergebnisse.

Primäre humane OA-Gewebe können nach TKA leicht gewonnen werden, was die hohe Häufigkeit von TKAs zu einer wertvollen Ressource für die Forschung macht. Zu den möglichen experimentellen Anwendungen gehören Genexpression und histologische Analysen. Um das Potenzial von primären menschlichen OA-Geweben für diese und andere Forschungsansätze zu realisieren, werden die folgenden Schlüsselüberlegungen skizziert. Erstens unterliegt die Verwendung von Patientenproben einer ethischen Regulierung, und die Protokolle müssen die Genehmigungen des Institutional Review Board (IRB) erfüllen²⁴. Zweitens machen die inhärente Heterogenität des primären erkrankten Gewebes des Menschen und der Einfluss von Variablen wie Alter und Geschlecht unter anderem die Notwendigkeit einer sorgfältigen Patientenauswahl (d.h. Anwendung von Zulassungskriterien) und Dateninterpretation erforderlich. Drittens können die einzigartigen biologischen Eigenschaften verschiedener Gewebe im Gelenk (z. B. geringe Zellularität von Knorpel und Meniskus²⁵⁾während der Experimente Herausforderungen darstellen (z. B. Isolierung der hohen Qualität und Quantität der RNA). Dieser Bericht befasst sich mit diesen Überlegungen und stellt ein Protokoll für die Patientenauswahl, Probenverarbeitung, Gewebehomogenisierung, RNA-Extraktion und Qualitätskontrolle (d. H. Bewertung der RNA-Reinheit und -Integrität; Abbildung 3) Förderung der Verwendung von primärem humanem OA-Gewebe in der Forschungsgemeinschaft.

Protocol

Dieses Studienprotokoll wurde genehmigt und folgte den institutionellen Richtlinien des Henry Ford Health System Institutional Review Board (IRB # 13995). 1. Patientenauswahl Identifizieren Sie die Patienten unter denen, die sich einer TKA mit einem orthopädischen Chirurgen unterziehen sollen. Wählen Sie die Patienten basierend auf den im Studienprotokoll definierten Zulassungskriterien aus. Beispiele für Einschlusskriterien sind das Alter von 18 Jahren oder älter und e…

Representative Results

Sieben einzigartige menschliche Kniegelenkgewebe stehen zur Entnahme von Patienten zur Verfügung, die sich einer TKA für OA unterziehen (Abbildung 1). In diesem Protokoll wurde jedes dieser Gewebe innerhalb von 4 Stunden nach der chirurgischen Entfernung identifiziert und verarbeitet (Abbildung 2). Nach den in Abbildung 3beschriebenen Schritten wurden Teile jedes Gewebes für die histologische Beurteilung formalinfixiert (<strong …

Discussion

Das vorgestellte Protokoll hat sich bei der Gewinnung von sieben primären menschlichen OA-Geweben für die RNA-Extraktion (Tabelle 1) und die histologische Verarbeitung (Abbildung 4) als erfolgreich erwiesen. Vor der Entnahme von Patientenproben ist es notwendig, ein vom IRB zugelassenes Protokoll zu erstellen, idealerweise in Zusammenarbeit mit einem Chirurgen oder einem chirurgischen Team. Die Anwendung eines standardisierten Protokolls für die Probenentnahme (z. B. Rese…

Materials

1.5 mL microcentrifuge tubes	Eppendorf	05 402	Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.
10% Formalin	Cardinal Health	C4320-101	Store in chemical cabinet when not in use.
100% Chloroform (Molecular Biology Grade)	Fisher Scientific	ICN19400290	Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use.
100% Ethanol (Molecular Biology Grade)	Fisher Scientific	BP2818500	Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, when diluting use DEPC/nuclease-free water.
100% Isopropanol (Molecular Biology Grade)	Fisher Scientific	AC327272500	Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use.
100% Reagent Alcohol	Cardinal Health	C4305	Diluted to 70% with dH2O for cleaning purposes.
15 cm sterile culture dishes	Thermo Scientific	12-556-003	Sterile, nuclease-free.
15 mL polypropylene (Falcon) tubes	Fisher Scientific	14 959 53A	Sterile, nuclease-free.
2 mL cryovials (externally threaded)	Fisher Scientific	10 500 26	Sterile, nuclease-free.
5 mL round-bottom tubes	Corning	352052	Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.
50 mL polypropylene (Falcon) tubes	Fisher Scientific	12 565 271	Sterile, nuclease-free.
Bioanalyzer	Agilent	G2939BA	For RNA integrity measurement.
Biosafety Cabinet	General lab equipment
Bone Cutters	Fisher Scientific	08 990	Sterilized with 70% EtOH.
Chemical Fume Hood	General lab equipment
Disposable Scalpels (No.10)	Thermo Scientific	3120032	Sterile, nuclease-free.
EDTA	Life Technologies	15-576-028	10% solution with dH2O.
Forceps	Any vendor		Sterilized with 70% EtOH.
Glycoblue Coprecipitant	Fisher Scientific	AM9516	Reserved for RNA work only, store at -20 °C.
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666
Liquid Nitrogen	Any vendor
Liquid Nitrogen Dewar	General lab equipment
Mortar and Pestle	Any vendor		Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol.
Nanodrop Spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-2000	For RNA purity and yield measurements.
Nuclease-free/DEPC-treated water	Fisher Scientific		Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.
PBS (Sterile)	Gibco	20 012 050	Sterile, nuclease-free.
Pipettes (2 µL, 20 µL, 200 µL, 1000 µL) & tips	Any vendor		Sterile, nuclease-free.
Plasma/Serum Advanced miRNA kit	Qiagen	217204
Refrigerated Centrifuge 5810R	Eppendorf	22625101
RNAlater	Thermo Scientific	50 197 8158	Sterile, nuclease-free.
RNAse Away/RNAseZap	Fisher Scientific	7002
Spatula (semimicro size)	Any vendor		Reserved for RNA work only.
Tissue homogenizer	Pro Scientific	01-01200	Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol.
TRIzol Reagent	Fisher Scientific	15 596 026	Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.