Coleta de tecidos e extração de RNA da articulação do joelho osteoartrítica humana

Summary

Os tecidos primários obtidos de pacientes após a artroplastia total do joelho fornecem um modelo experimental para a pesquisa da osteoartrite com tradução clínica máxima. Este protocolo descreve como identificar, processar e isolar o RNA de sete tecidos únicos do joelho para apoiar a investigação mecanicista na osteoartrite humana.

Abstract

A osteoartrite (OA) é uma doença articular crônica e degenerativa que mais frequentemente afeta o joelho. Como atualmente não há cura, a artroplastia total do joelho (TKA) é uma intervenção cirúrgica comum. Experimentos com tecidos OA humanos primários obtidos da TKA fornecem a capacidade de investigar mecanismos de doença ex vivo. Embora o OA tenha sido pensado anteriormente para impactar principalmente a cartilagem, agora é conhecido por impactar múltiplos tecidos na articulação. Este protocolo descreve a seleção do paciente, processamento de amostras, homogeneização de tecidos, extração de RNA e controle de qualidade (com base na pureza, integridade e rendimento do RNA) de cada um dos sete tecidos únicos para apoiar a investigação do mecanismo da doença na articulação do joelho. Com consentimento informado, foram obtidas amostras de pacientes submetidos à TKA para OA. Os tecidos foram dissecados, lavados e armazenados dentro de 4h de cirurgia por congelamento de flash para fixação de RNA ou formalina para histologia. Os tecidos coletados incluíam cartilagem articular, osso subcondral, menisco, almofada de gordura infrapator, ligamento cruzado anterior, sinodio e músculo oblíquo vasto medialis. Os protocolos de extração de RNA foram testados para cada tipo de tecido. A modificação mais significativa envolveu o método de desintegração usado para tecidos duros de baixa célula, alta matriz (considerados como cartilagem, osso e menisco) versus células relativamente altas, baixa matriz, tecidos moles (considerados como almofada de gordura, ligamento, sinodio e músculo). Verificou-se que a pulverização era adequada para tecidos duros, e a homogeneização era apropriada para tecidos moles. Observou-se uma propensão para alguns sujeitos de produzir valores de número de integridade de RNA (RIN) mais elevados do que outros sujeitos consistentemente em múltiplos tecidos, sugerindo que fatores subjacentes, como a gravidade da doença, podem impactar a qualidade do RNA. A capacidade de isolar o RNA de alta qualidade dos tecidos OA humanos primários fornece um modelo fisiologicamente relevante para experimentos sofisticados de expressão genética, incluindo sequenciamento, que podem levar a insights clínicos que são mais facilmente traduzidos para os pacientes.

Introduction

O joelho é a maior articulação sinovial do corpo humano, compreendendo a articulação tibiofemoral entre a tíbia e o fêmur e a articulação patelar entre a patela e o fêmur¹. Os ossos do joelho são forrados com cartilagem articular e apoiados por vários tecidos conjuntivos, incluindo menisco, gordura, ligamentos e músculo, e uma membrana sinovial encapsula toda a articulação para criar uma cavidade sintetizada cheia de^{fluidos 1,2,3} (Figura 1). Um joelho saudável funciona como uma articulação de dobradiça móvel que permite movimento sem atrito no plano frontal^1,3. Em condições patológicas, o movimento pode se tornar restrito e doloroso. A doença degenerativa mais comum nas articulações do joelho é a osteoartrite (AA)⁴. Sabe-se que uma variedade de fatores de risco predispõem ao desenvolvimento de OA, incluindo idade mais avançada, obesidade, sexo feminino, trauma articular e genética, entre outros^5,6. Atualmente, estima-se que existam 14 milhões de pessoas nos EUA com OA sintomático do joelho, com a prevalência aumentando devido ao aumento da idade populacional e às taxas de obesidade^7,8. Inicialmente considerada uma doença da cartilagem, a OA agora é entendida como uma doença de toda a articulação⁹. As alterações patológicas comumente observadas na OA incluem erosão articular da cartilagem, formação de osteofitas, espessamento ósseo subcondral e inflamação do sinolário^9,10. Como não há cura conhecida para OA, os tratamentos focam principalmente no tratamento de sintomas (por exemplo, dor)^11,12, e uma vez que o OA progrediu para o estágio final, a cirurgia de substituição articular é frequentemente indicada¹³.

As cirurgias de substituição articular podem ser substituições parciais ou totais do joelho, com artroplastia total do joelho (TKA), incluindo a substituição de toda a articulação tibiofemoral e a articulação patelar. A partir de 2020, aproximadamente 1 milhão de TKAs são realizados nos EUA a cada ano¹⁴. Durante a TKA, um cirurgião ortopédico resseca a porção superior do platô tibial e os condyles femorais inferiores(Figura 2A, 2B) a serem equipados com implantes protéticos. Às vezes mal interpretado pelos pacientes, em um TKA, apenas 8-10 mm é ressecado a partir da extremidade de cada osso, que é posteriormente tampado ou ressurgido, com metal. Um forro de polietileno interposto forma a superfície de rolamento (ou seja, estofamento) entre os dois implantes metálicos. Além disso, vários componentes de tecido mole da articulação são total ou parcialmente extirpados para alcançar o equilíbrio articular adequado. Entre esses tecidos estão o menisco medial e lateral(Figura 2C),bloco de gordura infrapator(Figura 2D),ligamento cruzado anterior (LCA; Figura 2E), sinovia(Figura 2F), e vasto músculo oblíquo de vastus medialis (VMO; Figura 2G) ¹⁵. Embora os TKAs sejam geralmente bem sucedidos para o tratamento de OA, cerca de 20% dos pacientes relatam recorrência de dor pós-cirurgia¹⁶. Juntamente com o alto custo e a invasividade relativa do procedimento, essas limitações apontam para a necessidade de novas pesquisas para identificar tratamentos alternativos para mitigar a progressão da OA.

Para explorar mecanismos de doenças em OA que possam apresentar novos caminhos para a intervenção terapêutica, podem ser utilizados sistemas experimentais, incluindo células, explantas teciduais e modelos animais. As células são tipicamente cultivadas em monocamadas e são derivadas de tecidos humanos ou animais primários (por exemplo, condrócitos isolados da cartilagem) ou células imortalizadas (por exemplo, ATDC5¹⁷ e CHON-001^18). Embora as células possam ser úteis para manipular variáveis experimentais em um ambiente de cultura controlada, elas não capturam condições da articulação natural que são conhecidas por impactar fenótipos^{celulares 19}. Para recapitular melhor a complexa cascata de comunicação química, mecânica e célula-celular subjacente OA, uma alternativa é encontrada em amostras primárias de tecido humano ou animal, sejam elas usadas como explants frescas ou cultivadas, para preservar a estrutura tecidual e o microambiente^{celular 20}. Para estudar a articulação in vivo,pequenos (por exemplo, mouse²¹) e grandes (por exemplo, cavalo²²) modelos animais para OA (por exemplo, por indução cirúrgica, alteração genética ou envelhecimento) também são úteis. No entanto, a tradução desses modelos para a doença humana pode ser limitada por diferenças anatômicas, fisiológicas e metabólicas, entre outras²³. Considerando as vantagens e desvantagens dos sistemas experimentais, os principais pontos fortes de serem específicos das espécies e manter o nicho extracelular oferecido pelos tecidos OA humanos primários maximizam o potencial translacional dos achados da pesquisa.

Tecidos OA humanos primários podem ser facilmente obtidos após a TKA, tornando a alta frequência de TKAs um recurso valioso para a pesquisa. Entre as aplicações experimentais potenciais estão expressão genética e análises histológicas. Para perceber o potencial dos tecidos OA humanos primários para essas abordagens de pesquisa e outros, delineados são as seguintes considerações-chave. Em primeiro lugar, o uso de amostras de pacientes está sujeito a regulação ética, e os protocolos devem atender às aprovações do Conselho de Revisão Institucional (IRB)²⁴. Em segundo lugar, a heterogeneidade inerente aos tecidos primários doentes humanos e a influência de variáveis como idade e sexo, entre outras, criam a necessidade de seleção cuidadosa do paciente (ou seja, aplicação de critérios de elegibilidade) e interpretação dos dados. Em terceiro lugar, as propriedades biológicas únicas de diferentes tecidos na articulação (por exemplo, baixa celularidade da cartilagem e menisco²⁵) podem apresentar desafios durante os experimentos (por exemplo, isolando alta qualidade e quantidade de RNA). Este relatório aborda essas considerações e apresenta um protocolo para seleção de pacientes, processamento de amostras, homogeneização de tecidos, extração de RNA e controle de qualidade (ou seja, avaliação da pureza e integridade do RNA; Figura 3) para incentivar o uso de tecidos OA humanos primários na comunidade de pesquisa.

Protocol

Este protocolo de estudo foi aprovado e seguiu as diretrizes institucionais estabelecidas pelo Conselho de Revisão Institucional do Sistema de Saúde Henry Ford (IRB nº 13995). 1. Seleção de pacientes Identificar os pacientes entre os agendados para serem submetidos à TKA com um cirurgião ortopédico. Selecione os pacientes com base nos critérios de elegibilidade definidos pelo protocolo de estudo. Exemplos de critérios de inclusão incluem ter 18 anos ou mais e ter…

Representative Results

Sete tecidos articulares humanos únicos estão disponíveis para coleta de pacientes submetidos a TKA para OA(Figura 1). Neste protocolo, cada um desses tecidos foi identificado e processado dentro de 4h de remoção cirúrgica(Figura 2). Seguindo as etapas descritas na Figura 3,as porções de cada tecido foram fixadas para avaliação histológica(Figura 4),enquanto outras porções foram congeladas …

Discussion

O protocolo apresentado mostrou-se bem sucedido na coleta de sete tecidos OA humanos primários para extração de RNA(Tabela 1) e processamento histológico(Figura 4). Antes de coletar amostras de pacientes, é necessário estabelecer um protocolo aprovado pelo IRB, idealmente em colaboração com um cirurgião ou equipe cirúrgica. A aplicação de um protocolo padronizado para coleta de amostras (por exemplo, ressecção de locais in situ consistentes) é essenci…

Materials

1.5 mL microcentrifuge tubes	Eppendorf	05 402	Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.
10% Formalin	Cardinal Health	C4320-101	Store in chemical cabinet when not in use.
100% Chloroform (Molecular Biology Grade)	Fisher Scientific	ICN19400290	Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use.
100% Ethanol (Molecular Biology Grade)	Fisher Scientific	BP2818500	Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, when diluting use DEPC/nuclease-free water.
100% Isopropanol (Molecular Biology Grade)	Fisher Scientific	AC327272500	Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use.
100% Reagent Alcohol	Cardinal Health	C4305	Diluted to 70% with dH2O for cleaning purposes.
15 cm sterile culture dishes	Thermo Scientific	12-556-003	Sterile, nuclease-free.
15 mL polypropylene (Falcon) tubes	Fisher Scientific	14 959 53A	Sterile, nuclease-free.
2 mL cryovials (externally threaded)	Fisher Scientific	10 500 26	Sterile, nuclease-free.
5 mL round-bottom tubes	Corning	352052	Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.
50 mL polypropylene (Falcon) tubes	Fisher Scientific	12 565 271	Sterile, nuclease-free.
Bioanalyzer	Agilent	G2939BA	For RNA integrity measurement.
Biosafety Cabinet	General lab equipment
Bone Cutters	Fisher Scientific	08 990	Sterilized with 70% EtOH.
Chemical Fume Hood	General lab equipment
Disposable Scalpels (No.10)	Thermo Scientific	3120032	Sterile, nuclease-free.
EDTA	Life Technologies	15-576-028	10% solution with dH2O.
Forceps	Any vendor		Sterilized with 70% EtOH.
Glycoblue Coprecipitant	Fisher Scientific	AM9516	Reserved for RNA work only, store at -20 °C.
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666
Liquid Nitrogen	Any vendor
Liquid Nitrogen Dewar	General lab equipment
Mortar and Pestle	Any vendor		Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol.
Nanodrop Spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-2000	For RNA purity and yield measurements.
Nuclease-free/DEPC-treated water	Fisher Scientific		Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.
PBS (Sterile)	Gibco	20 012 050	Sterile, nuclease-free.
Pipettes (2 µL, 20 µL, 200 µL, 1000 µL) & tips	Any vendor		Sterile, nuclease-free.
Plasma/Serum Advanced miRNA kit	Qiagen	217204
Refrigerated Centrifuge 5810R	Eppendorf	22625101
RNAlater	Thermo Scientific	50 197 8158	Sterile, nuclease-free.
RNAse Away/RNAseZap	Fisher Scientific	7002
Spatula (semimicro size)	Any vendor		Reserved for RNA work only.
Tissue homogenizer	Pro Scientific	01-01200	Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol.
TRIzol Reagent	Fisher Scientific	15 596 026	Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.