Vävnadsuppsamling och RNA-extraktion från den mänskliga osteoarthritiska knäleden
Summary
Primära vävnader som erhållits från patienter efter total knä artroplastik ger en experimentell modell för artros forskning med maximal klinisk översättningsbarhet. Detta protokoll beskriver hur man identifierar, bearbetar och isolerar RNA från sju unika knä vävnader för att stödja mekanistisk undersökning i mänskliga artros.
Abstract
Artros (OA) är en kronisk och degenerativ ledsjukdom som oftast påverkar knäet. Eftersom det för närvarande inte finns något botemedel är total knä artroplastik (TKA) ett vanligt kirurgiskt ingrepp. Experiment med primära mänskliga OA vävnader som erhållits från TKA ger förmågan att undersöka sjukdomsmekanismer ex vivo. Medan OA tidigare troddes påverka främst brosk, är det nu känt att påverka flera vävnader i leden. Detta protokoll beskriver patientens urval, prov bearbetning, vävnad homogenisering, RNA extraktion och kvalitetskontroll (baserat på RNA renhet, integritet och avkastning) från var och en av sju unika vävnader för att stödja sjukdom mekanism undersökning i knä leden. Med informerat samtycke erhölls prover från patienter som genomgår TKA för OA. Vävnader dissekerades, tvättades och lagrades inom 4 h av kirurgi genom flash frysning för RNA eller formalin fixering för histologi. Insamlade vävnader ingår articular brosk, subchondral ben, menisk, infrapatellar fett pad, främre korsband, synovium och vastus medialis sneda muskeln. RNA extraktionsprotokoll testades för varje vävnadstyp. Den viktigaste modifieringen involverade metoden för sönderfall som används för lågcelliga, högmatris, hårda vävnader (betraktas som brosk, ben och menisk) jämfört med relativt högcelliga, lågmatris, mjuka vävnader (betraktas som fettkudde, ligament, synovium och muskel). det konstaterades att pulverisering var lämplig för hårda vävnader, och homogenisering var lämplig för mjuka vävnader. En proclivity för vissa försökspersoner att ge högre RNA integritet tal (RIN) värden än andra ämnen konsekvent över flera vävnader observerades, vilket tyder på att underliggande faktorer såsom sjukdomens svårighetsgrad kan påverka RNA kvalitet. Förmågan att isolera högkvalitativt RNA från primära mänskliga OA-vävnader ger en fysiologiskt relevant modell för sofistikerade genuttrycksexperiment, inklusive sekvensering, som kan leda till kliniska insikter som lättare översätts till patienter.
Introduction
Knäet är den största synoviala leden i människokroppen, bestående av den tibiofemorala leden mellan skenbenet och lårbenet och patellofemoralleden mellan patella och lårbenet1. Benen i knäet är fodrade med ledbrosk och stöds av olika bindväv, inklusive menisci, fett, ligament och muskler, och ett synovialmembran kapslar in hela leden för att skapa en synovial vätskefylld hålighet1,2,3 ( figur1). Ett friskt knä fungerar som en mobil gångjärnsled som möjliggör friktionsfri rörelse i frontplanet1,3. Under patologiska förhållanden kan rörelse bli begränsad och smärtsam. Den vanligaste degenerativa knäledssjukdomen är artros (OA)4. En mängd olika riskfaktorer är kända för att predisponera för OA-utveckling, inklusive äldre ålder, fetma, kvinnligt kön, ledtrauma och genetik, bland annat5,6. Det finns för närvarande uppskattningsvis 14 miljoner människor i USA med symtomatiskt knä OA, med prevalensen ökar på grund av stigande befolkningsålder och fetma7,8. Ursprungligen anses vara en sjukdom i brosket, OA förstås nu som en sjukdom i hela leden9. Vanliga patologiska förändringar i OA inkluderar ledbroskerosion, osteofytbildning, subkondral benförtjockning och inflammation i synovium9,10. Eftersom det inte finns något känt botemedel mot OA, fokuserar behandlingarna främst på symtom (t.ex. smärta) hantering11,12, och när OA har utvecklats till slutstadiet, är ledproteskirurgi ofta indicerat13.
Gemensamma ersätter operationer kan antingen vara partiella eller totala knä ersätter, med totala knä artroplastik (TKA) inklusive ersätta hela tibiofemoral artikulering och patellofemoral gemensamma. Från och med 2020 utförs cirka 1 miljon TKA i USA varje år14. Under TKA resects en ortopedisk kirurg den övre delen av tibialplatån och de nedre femorala kondyler (figur 2A, 2B) som ska förses med protesimplantat. Ibland feltolkas av patienter, i en TKA, endast 8-10 mm återförsluts från slutet av varje ben, som därefter är täckt eller ytbehandlas, med metall. Ett interposed polyetenfoder bildar lagerytan (dvs. stoppning) mellan de två metallimplantaten. Dessutom är flera mjukvävnadskomponenter i leden helt eller delvis strukna för att uppnå korrekt ledbalans. Bland dessa vävnader finns mediala och laterala menisci (figur 2C), infrapatellar fett pad (figur 2D), främre korsband (ACL; Figur 2E), synovium (figur 2F)och vastus medialis sned muskel (VMO; Bild 2G) 15. Även om TKA i allmänhet är framgångsrika för OA-behandling, rapporterar cirka 20% av patienterna återkommande smärta efter operationen16. Tillsammans med den höga kostnaden och den relativa invasiviteten i förfarandet pekar dessa begränsningar på behovet av ytterligare forskning för att identifiera alternativa behandlingar för att mildra utvecklingen av OA.
För att utforska sjukdomsmekanismer i OA som kan presentera nya vägar för terapeutisk intervention, experimentella system, inklusive celler, vävnad explanter och djurmodeller kan användas. Celler odlas vanligtvis i monolager och härrör från primära vävnader från människor eller djur (t.ex. kondrocyter isolerade från brosk) eller odödliga celler (t.ex. ATDC517 och CHON-00118). Medan celler kan vara användbara för att manipulera experimentella variabler i en kontrollerad kulturmiljö, fångar de inte förhållanden i den naturliga leden som är kända för att påverka cellfenotyper19. För att bättre rekapitulera den komplexa kaskaden av kemisk, mekanisk och cell-till-cell-kommunikation som ligger till grund för OA, finns ett alternativ i primära vävnadsprover från människor eller djur, oavsett om de används färska eller odlade ex vivo som explanter, för att bevara vävnadsstrukturen och cellmikromiljön20. För att studera leden in vivoär små (t.ex. mus21)och stora (t.ex. häst22)djurmodeller för OA (t.ex. genom kirurgisk induktion, genetisk förändring eller åldrande) också användbara. Översättning från dessa modeller till mänsklig sjukdom kan dock begränsas av anatomiska, fysiologiska och metaboliska skillnader, bland annat23. Med tanke på fördelarna och nackdelarna med experimentella system maximerar de viktigaste styrkorna med att vara artspecifik och upprätthålla den extracellulära nisch som erbjuds av de primära mänskliga OA-vävnaderna den translationella potentialen hos forskningsresultat.
Primära mänskliga OA vävnader kan lätt erhållas efter TKA, vilket gör den höga frekvensen av TKAs en värdefull resurs för forskning. Bland potentiella experimentella tillämpningar finns genuttryck och histologiska analyser. För att förverkliga potentialen hos primära mänskliga OA vävnader för dessa forskningsmetoder och andra, beskrivs följande viktiga överväganden. För det första är användningen av patientprover föremål för etisk reglering, och protokollen måste uppfylla IRB-godkännanden (Institutional Review Board)24. För det andra skapar den inneboende heterogeniteten hos mänskliga primära sjuka vävnader och påverkan av variabler som ålder och kön, bland annat, behovet av noggrant patientval (dvs. tillämpning av behörighetskriterier) och datatolkning. För det tredje kan de unika biologiska egenskaperna hos olika vävnader i leden (t.ex. låg cellulärhet av brosk och menisk25) innebära utmaningar under experiment (t.ex. isolera hög kvalitet och kvantitet av RNA). Denna rapport behandlar dessa överväganden och presenterar ett protokoll för patientval, provbehandling, vävnad homogenisering, RNA extraktion och kvalitetskontroll (dvs. bedömning av RNA renhet och integritet; Bild 3) att uppmuntra användningen av primära mänskliga OA vävnader i forskarsamhället.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollet som presenteras har visat sig vara framgångsrikt för att samla in sju primära mänskliga OA-vävnader för RNA-extraktion(tabell 1) och histologisk bearbetning(figur 4). Innan du samlar in patientprover är det nödvändigt att upprätta ett IRB-godkänt protokoll, helst i samarbete med en kirurg eller ett kirurgiskt team. Att tillämpa ett standardiserat protokoll för provsamling (t.ex. omsektion från konsekventa platser på plats) är avgörande f…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar studiedeltagarna som gjorde denna forskning möjlig och tillägnar denna rapport till nya forskare inom artrosområdet.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Eppendorf | 05 402 | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only. |
| 10% Formalin | Cardinal Health | C4320-101 | Store in chemical cabinet when not in use. |
| 100% Chloroform (Molecular Biology Grade) | Fisher Scientific | ICN19400290 | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use. |
| 100% Ethanol (Molecular Biology Grade) | Fisher Scientific | BP2818500 | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, when diluting use DEPC/nuclease-free water. |
| 100% Isopropanol (Molecular Biology Grade) | Fisher Scientific | AC327272500 | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use. |
| 100% Reagent Alcohol | Cardinal Health | C4305 | Diluted to 70% with dH2O for cleaning purposes. |
| 15 cm sterile culture dishes | Thermo Scientific | 12-556-003 | Sterile, nuclease-free. |
| 15 mL polypropylene (Falcon) tubes | Fisher Scientific | 14 959 53A | Sterile, nuclease-free. |
| 2 mL cryovials (externally threaded) | Fisher Scientific | 10 500 26 | Sterile, nuclease-free. |
| 5 mL round-bottom tubes | Corning | 352052 | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only. |
| 50 mL polypropylene (Falcon) tubes | Fisher Scientific | 12 565 271 | Sterile, nuclease-free. |
| Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | For RNA integrity measurement. |
| Biosafety Cabinet | General lab equipment | ||
| Bone Cutters | Fisher Scientific | 08 990 | Sterilized with 70% EtOH. |
| Chemical Fume Hood | General lab equipment | ||
| Disposable Scalpels (No.10) | Thermo Scientific | 3120032 | Sterile, nuclease-free. |
| EDTA | Life Technologies | 15-576-028 | 10% solution with dH2O. |
| Forceps | Any vendor | Sterilized with 70% EtOH. | |
| Glycoblue Coprecipitant | Fisher Scientific | AM9516 | Reserved for RNA work only, store at -20 °C. |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666 | |
| Liquid Nitrogen | Any vendor | ||
| Liquid Nitrogen Dewar | General lab equipment | ||
| Mortar and Pestle | Any vendor | Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol. | |
| Nanodrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-2000 | For RNA purity and yield measurements. |
| Nuclease-free/DEPC-treated water | Fisher Scientific | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only. | |
| PBS (Sterile) | Gibco | 20 012 050 | Sterile, nuclease-free. |
| Pipettes (2 µL, 20 µL, 200 µL, 1000 µL) & tips | Any vendor | Sterile, nuclease-free. | |
| Plasma/Serum Advanced miRNA kit | Qiagen | 217204 | |
| Refrigerated Centrifuge 5810R | Eppendorf | 22625101 | |
| RNAlater | Thermo Scientific | 50 197 8158 | Sterile, nuclease-free. |
| RNAse Away/RNAseZap | Fisher Scientific | 7002 |
|
| Spatula (semimicro size) | Any vendor | Reserved for RNA work only. | |
| Tissue homogenizer | Pro Scientific | 01-01200 | Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol. |
| TRIzol Reagent | Fisher Scientific | 15 596 026 | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only. |
References
- Gupton, M., Imonugo, O., Terreberry, R. R. . Anatomy, Bony Pelvis, and Lover Limb, Knee. , (2020).
- Pacifici, M., Koyama, E., Iwamoto, M. Mechanisms of Synovial joint and articular cartilage formation: recent advances, but many lingering mysteries. Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. 75 (3), 237-248 (2005).
- Gupton, M., Munjal, A., Terreberry, R. R. . Anatomy, Hinge Joints. , (2020).
- Chen, D., et al. Osteoarthritis: Toward a comprehensive understanding of pathological mechanism. Bone Research. 5, 16044 (2017).
- Murphy, L., et al. Lifetime risk of symptomatic knee osteoarthritis. Arthritis & Rheumatism. 59 (9), 1207-1213 (2008).
- O’Neill, T. W., McCabe, P. S., McBeth, J. Update on the epidemiology, risk factors and disease outcomes of osteoarthritis. Best Practice & Research: Clinical Anaesthesiology. 32 (2), 312-326 (2018).
- Nguyen, U. S., et al. Increasing prevalence of knee pain and symptomatic knee osteoarthritis: survey and cohort data. Annals of Internal Medicine. 155 (11), 725-732 (2011).
- Deshpande, B. R., et al. Number of persons with symptomatic knee osteoarthritis in the us: impact of race and ethnicity, age, sex, and obesity. Arthritis Care & Research. 68 (12), 1743-1750 (2016).
- Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ. Arthritis & Rheumatism. 64 (6), 1697-1707 (2012).
- McGonagle, D., Tan, A. L., Carey, J., Benjamin, M. The anatomical basis for a novel classification of osteoarthritis and allied disorders. Journal of Anatomy. 216 (3), 279-291 (2010).
- Bannuru, R. R., et al. OARSI guidelines for the non-surgical management of knee, hip, and polyarticular osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 27 (11), 1578-1589 (2019).
- Kolasinski, S. L., et al. American College of Rheumatology/Arthritis Foundation Guideline for the Management of Osteoarthritis of the Hand, Hip, and knee. Arthritis Care & Research. 72 (2), 220-233 (2020).
- Michael, J. W., Schluter-Brust, K. U., Eysel, P. The epidemiology, etiology, diagnosis, and treatment of osteoarthritis of the knee. Deutsches Ärzteblatt International. 107 (9), 152-162 (2010).
- Singh, J. A., Yu, S., Chen, L., Cleveland, J. D. Rates of total joint replacement in the United States: Future projections to 2020-2040 using the national inpatient sample. Journal of Rheumatology. 46 (9), 1134-1140 (2019).
- Gemayel, A. C., Varacallo, M. Total Knee Replacement Techniques. StatPearls. , (2020).
- Shan, L., Shan, B., Suzuki, A., Nouh, F., Saxena, A. Intermediate and long-term quality of life after total knee replacement: a systematic review and meta-analysis. Journal of Bone and Joint Surgery (American Volume). 97 (2), 156-168 (2015).
- Newton, P. T., et al. Chondrogenic Atdc5 cells: an optimised model for rapid and physiological matrix mineralisation. International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1187-1193 (2012).
- Chuang, Y. W., et al. Lysophosphatidic acid enhanced the angiogenic capability of human chondrocytes by regulating Gi/Nf-Kb-dependent angiogenic factor expression. PLoS One. 9 (5), 95180 (2014).
- Johnson, C. I., Argyle, D. J., Clements, D. N. In vitro models for the study of osteoarthritis. Veterinary Journal. 209, 40-49 (2016).
- Grivel, J. C., Margolis, L. Use of human tissue explants to study human infectious agents. Nature Protocols. 4 (2), 256-269 (2009).
- Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (dmm) model of osteoarthritis in the 129/Svev mouse. Osteoarthritis Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
- McIlwraith, C. W., Frisbie, D. D., Kawcak, C. E. The horse as a model of naturally occurring osteoarthritis. Bone & Joint Research. 1 (11), 297-309 (2012).
- Cope, P. J., Ourradi, K., Li, Y., Sharif, M. Models of Osteoarthritis: The good, the bad and the promising. Osteoarthritis Cartilage. 27 (2), 230-239 (2019).
- Goldenberg, A. J., et al. IRB practices and policies regarding the secondary research use of biospecimens. Bmc Medical Ethics. 16, 32 (2015).
- Ruettger, A., Neumann, S., Wiederanders, B., Huber, R. Comparison of different methods for preparation and characterization of total rna from cartilage samples to uncover osteoarthritis in vivo. BMC Research Notes. 3, 7 (2010).
- Reno, C., Marchuk, L., Sciore, P., Frank, C. B., Hart, D. A. Rapid isolation of total RNA from small samples of hypocellular, dense connective tissues. BioTechniques. 22 (6), 1082-1086 (1997).
- Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. The basic science of human knee menisci: structure, composition, and function. Sports Health. 4 (4), 340-351 (2012).
- Carballo, C. B., Nakagawa, Y., Sekiya, I., Rodeo, S. A. Basic science of articular cartilage. Clinics in Sports Medicine. 36 (3), 413-425 (2017).
- Le Bleu, H. K., et al. Extraction of high-quality RNA from human articular cartilage. Analytical Biochemistry. 518, 134-138 (2017).
- Ali, S. A., Alman, B. RNA extraction from human articular cartilage by chondrocyte isolation. Analytical Biochemistry. 429 (1), 39-41 (2012).
- Schroeder, A., et al. The Rin: An RNA integrity number for assigning integrity values to rna measurements. BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).
- Li, S., et al. Multi-platform assessment of transcriptome profiling using RNA-seq in the abrf next-generation sequencing study. Nature Biotechnology. 32 (9), 915-925 (2014).
- Nazarov, P. V., et al. RNA sequencing and transcriptome arrays analyses show opposing results for alternative splicing in patient derived samples. BMC Genomics. 18 (1), 443 (2017).
- Madissoon, E., et al. scRNA-seq assessment of the human lung, spleen, and esophagus tissue stability after cold preservation. Genome Biology. 21 (1), (2019).
- Scholes, A. N., Lewis, J. A. Comparison of RNA isolation methods on RNA-seq: implications for differential expression and meta-analyses. BMC Genomics. 21 (1), 249 (2020).
- Smith, M. D. The normal synovium. Open Rheumatology Journal. 5, 100-106 (2011).
- Kukurba, K. R., Montgomery, S. B. RNA sequencing and analysis. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (11), 951-969 (2015).
- Mobasheri, A., Kapoor, M., Ali, S. A., Lang, A., Madry, H. The future of deep phenotyping in osteoarthritis: how can high throughput omics technologies advance our understanding of the cellular and molecular taxonomy of the disease. Osteoarthritis and Cartilage Open. 3 (2), 100144 (2021).
