Producción de vectores de virus adenoasociados en pilas celulares para estudios preclínicos en modelos animales grandes
Summary
Aquí proporcionamos un procedimiento detallado para la producción a gran escala de vectores AAV de grado de investigación utilizando células HEK 293 adherentes cultivadas en pilas celulares y purificación por cromatografía de afinidad. Este protocolo produce consistentemente >1 x 1013 genomas vectoriales / ml, proporcionando cantidades vectoriales apropiadas para estudios con animales grandes.
Abstract
Los vectores de virus adenoasociados (AAV) se encuentran entre los vectores de terapia génica clínicamente más avanzados, con tres terapias génicas AAV aprobadas para humanos. El avance clínico de nuevas aplicaciones para AAV implica la transición de modelos de animales pequeños, como ratones, a modelos animales más grandes, incluidos perros, ovejas y primates no humanos. Una de las limitaciones de la administración de AAV a animales más grandes es el requisito de grandes cantidades de virus de alto título. Si bien el cultivo celular en suspensión es un método escalable para la producción de vectores AAV, pocos laboratorios de investigación tienen el equipo (por ejemplo, biorreactores) o saben cómo producir AAV de esta manera. Además, los títulos de AAV a menudo son significativamente más bajos cuando se producen en células HEK 293 en suspensión en comparación con las células HEK293 adherentes. Aquí se describe un método para producir grandes cantidades de AAV de alto título utilizando pilas de celdas. También se describe un protocolo detallado para la titulación de AAV, así como métodos para validar la pureza del vector. Finalmente, se presentan resultados representativos de la expresión de transgenes mediada por AAV en un modelo de oveja. Este protocolo optimizado para la producción a gran escala de vectores AAV en células adherentes permitirá a los laboratorios de biología molecular avanzar en las pruebas de sus nuevas terapias AAV en modelos animales más grandes.
Introduction
La terapia génica que utiliza vectores de virus adenoasociados (AAV) ha logrado grandes avances en las últimas tres décadas1,2. Las mejoras demostradas en una amplia gama de enfermedades genéticas, incluida la ceguera congénita, la hemofilia y las enfermedades del sistema musculoesquelético y nervioso central, han llevado la terapia génica AAV a la vanguardia de la investigación clínica3,4. En 2012, la Agencia Europea de Medicamentos (EMA) aprobó Glybera, un vector AAV1 que expresa lipoproteína lipasa (LPL) para el tratamiento de la deficiencia de LPL, lo que la convierte en la primera autorización de comercialización para un tratamiento de terapia génica en Europa o estados Unidos5. Desde entonces, dos terapias génicas AAV adicionales, Luxturna6 y Zolgensma7,han recibido la aprobación de la FDA, y se espera que el mercado se expanda rápidamente en los próximos 5 años con hasta 10-20 terapias génicas esperadas para 20258. Los datos clínicos disponibles indican que la terapia génica AAV es una modalidad segura, bien tolerada y eficaz, lo que la convierte en uno de los vectores virales más prometedores, con más de 244 ensayos clínicos con AAV registrados con ClinicalTrials.gov. El creciente interés en las aplicaciones clínicas que involucran vectores AAV requiere métodos de producción robustos y escalables para facilitar la evaluación de las terapias AAV en modelos animales grandes, ya que este es un paso crítico en la tubería traslacional9.
Para la producción de vectores AAV, los dos requisitos principales son el genoma AAV y la cápside. El genoma de tipo salvaje (wt)-AAV es ADN monocatenario que tiene aproximadamente 4,7 kb de longitud10. El genoma wt-AAV comprende repeticiones terminales invertidas (ITR) que se encuentran en ambos extremos del genoma, que son importantes para el empaquetado, y los genes rep y cap 11. Los genes rep y cap, necesarios para la replicación del genoma, el ensamblaje de la cápside viral y la encapsulación del genoma en la cápside viral, se eliminan del genoma viral y se proporcionan en trans para la producción de vectores AAV12. La eliminación de estos genes del genoma viral proporciona espacio para transgenes terapéuticos y todos los elementos reguladores necesarios, incluidos el promotor y la señal de poliA. Los RTI permanecen en el genoma del vector para garantizar la replicación adecuada del genoma y la encapsulación viral13,14. Para mejorar la cinética de la expresión transgénica, los genomas vectoriales AAV pueden diseñarse para ser autocomplementarios, lo que mitiga la necesidad de conversión de ADN de cadena simple a doble cadena durante la replicación del genoma AAV, pero reduce la capacidad de codificación a ~ 2.4 kb15.
Más allá del diseño del genoma AAV, la selección del serotipo de la cápside determina el tropismo tisular y celular del vector AAV in vivo2. Además del tropismo tisular, se ha demostrado que diferentes serotipos de AAV muestran diferentes cinéticas de expresióngénica 16. Por ejemplo, Zincarelli et al.17 clasificaron diferentes serotipos de AAV en serotipos de baja expresión (AAV2, 3, 4, 5), serotipos de expresión moderada (AAV1, 6, 8) y serotipos de alta expresión (AAV7 y 9). También clasificaron los serotipos de AAV en expresión de inicio lento (AAV2, 3, 4, 5) o expresión de inicio rápido (AAV1, 6, 7, 8 y 9). Estos tropismos divergentes y la cinética de expresión génica se deben a variaciones de aminoácidos en las proteínas de la cápside, formaciones de proteínas de la cápside e interacciones con los receptores/co-receptores de la célula huésped18. Algunas cápsides AAV tienen características beneficiosas adicionales, como la capacidad de cruzar la barrera hematoencefálica después de la administración intravascular (AAV9) o residen en células musculares de larga vida para una expresión transgénica duradera (AAV6, 6.2FF, 8 y 9)19,20.
Este artículo tiene como objetivo detallar un método rentable para producir vectores AAV de alta pureza, alto título y grado de investigación para su uso en modelos preclínicos de animales grandes. La producción de AAV utilizando este protocolo se logra utilizando la transfección de doble plásmido en células adherentes de riñón embrionario humano (HEK)293 cultivadas en pilas celulares. Además, el estudio describe un protocolo para la purificación por cromatografía de afinidad de sulfato de heparina, que se puede utilizar para serotipos AAV que contienen dominios de unión a heparina, incluidos AAV2, 3, 6, 6.2FF, 13 y DJ21,22.
Hay varios sistemas de envasado disponibles para la producción de vectores AAV. Entre estos, el uso de un sistema de coinfección de dos plásmidos, en el que los genes Rep y Cap y los genes auxiliares de Ad (E1A, E1B55K, E2A, E4orf6 y ARN VA) están contenidos dentro de un plásmido (pHelper), tiene algunas ventajas prácticas sobre el método común de transfección de tres plásmidos (triple), incluido el costo reducido para la producción de plásmidos23,24 . El plásmido del genoma AAV que contiene el casete de expresión transgénica (pTransgene), debe estar flanqueado por RTI, y no debe exceder ~ 4.7 kb de longitud. El título y la pureza del vector pueden verse afectados por el transgén debido a los posibles efectos citotóxicos durante la transfección. La evaluación de la pureza del vector se describe en este documento. Los vectores producidos utilizando este método, que producen un 1 x 1013 vg / ml para cada uno, se evaluaron en ratones, hámsteres y modelos animales ovinos.
Tabla 1: Composición de las soluciones requeridas. Información necesaria, incluidos porcentajes y volúmenes, de los componentes necesarios para diversas soluciones a lo largo del protocolo. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Protocol
Representative Results
Discussion
La producción de vectores AAV recombinantes (rAAV) descritos en este documento utiliza materiales, reactivos y equipos comunes que se encuentran en la mayoría de los laboratorios e instalaciones de investigación de biología molecular. Este papel permite que el lector produzca rAAV de alta calidad in vitro e in vivo. Sobre todo, este protocolo para la producción de rAAV, en comparación con los protocolos más tediosos que implican la purificación de cloruro de cesio, es eficiente y evita el uso de…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Amira D. Rghei, Brenna A. Y. Stevens, Sylvia P. Thomas y Jacob G. E. Yates recibieron estipendios para estudiantes de la Facultad de Veterinaria de Ontario, así como becas para graduados de Ontario. Amira D. Rghei recibió un Mitacs Accelerate Studentship. Este trabajo fue financiado por la Subvención del Proyecto de los Institutos Canadienses para la Investigación en Salud (CIHR) (# 66009) y una subvención de Proyectos de Investigación en Salud Colaborativa (NSERC asociada) (# 433339) a SKW.
Materials
| 0.22 μm filter | Millipore Sigma | S2GPU05RE | |
| 0.25% Trypsin | Fisher Scientific | SM2001C | |
| 1-Butanol | Thermo Fisher Scientific | A399-4 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| 10 chamber cellstack | Corning | 3271 | |
| 1L PETG bottle | Thermo Fisher Scientific | 2019-1000 | |
| 30% Acrylamide/Bis Solution | Bio-Rad | 1610158 | |
| 96-well skirted plate | FroggaBio | FS-96 | |
| Adhesive plate seals | Thermo Fisher Scientific | 08-408-240 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Bio-Rad | 161-0700 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| Blood and Tissue Clean up Kit | Qiagen | 69506 | Use for DNA clean up in section 4.6 of protocol |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | B392-5 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| Cell Culture Dishes | Greiner bio-one | 7000232 | 15 cm plates |
| Culture Conical Tube | Thermo Fisher Scientific | 339650 | 15 mL conical tube |
| Culture Conical Tube | Fisher Scientific | 14955240 | 50 mL conical tube |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with 1000 mg/L D-glucose, L-glutamine | Cytiva Life Sciences | SH30022.01 | |
| ECL Western Blotting Substrate | Thermo Fisher Scientific | 32209 | |
| Ethanol | Greenfield | P016EA95 | Dilute ethyl alcohol(95% vol) to 20% for section 3.7.4 and 70% for section 6.1.1.1 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | SH30396.03 | |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A38-500 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-500 | |
| HBSS with Mg2+ and Ca2+ | Thermo Fisher Scientific | SH302268.02 | |
| HBSS without Mg2+ and Ca2+ | Thermo Fisher Scientific | SH30588.02 | |
| HEK293 cells | American Tissue Culture Collection | CRL-1573 | Upon receipt, thaw the cells and culture as described in manufacturer’s protocol. Once cells have been minimally passaged and are growing well, freeze a subfraction for future in aliquots and store in liquid nitrogen. Always use cells below passage number 30. Once cultured cells have been passaged more than 30 times, it is recommended to restart a culture from the stored aliquots |
| HEK293 host cell protein ELISA kit | Cygnus Technologies | F650S | Follow manufacturer’s instructions |
| Heparin sulfate column | Cytiva Life Sciences | 17040703 | |
| Kimwipe | Thermo Fisher Scientific | KC34120 | |
| L-glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | SH30034.02 | |
| Large Volume Centrifuge Tube Support Cushion | Corning | CLS431124 | Support cushion must be used with large volume centrifuge tubes uless the centrifuge rotor has the approriate V-bottom cushions |
| Large Volume Centrifuge Tubes | Corning | CLS431123-6EA | 500 mL centrifuge tubes |
| MgCl2 | Thermo Fisher Scientific | 7791-18-6 | |
| Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | 1.5 mL microcentrifuge tube, sterilize prior to use |
| Molecular Grade Water | Cytiva Life Sciences | SH30538.03 | |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma Aldrich | L5125 | CAUTION. Wear gloves |
| NaCl | Thermo Fisher Scientific | BP35810 | |
| Optimem, reduced serum medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | Sterilize prior to use |
| PBS (10x) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | Dilute to 1x for use on cells |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Cytiva Life Sciences | SV30010 | |
| pHelper plasmid | De novo design or obtained from plasmid repository | NA | |
| Pipet basin | Thermo Fisher Scientific | 13-681-502 | Purchase sterile pipet basins |
| Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100) | Thermo Fisher Scientific | 9002-93-1 | CAUTION. Wear gloves |
| Polyethylenimine (PEI) | Polyscience | 24765-1 | Follow manufacturer’s instructions to produce a 1L solution. 0.22μm filter and store at 4°C |
| Polypropylene semi-skirted PCR Plate | FroggaBio | WS-96 | |
| Polysorbate 20 (Tween 20) | Thermo Fisher Scientific | BP337-100 | CAUTION. Wear gloves |
| polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Cytiva Life Sciences | 10600023 | Use forceps to manipulate. Wear gloves. |
| Primary antibody | Progen | 65158 | |
| Protein Ladder | FroggaBio | PM008-0500 | |
| Proteinase K | Thermo Fisher Scientific | AM2546 | |
| pTrangene plasmid | De novo design or obtained from plasmid repository | NA | Must contain SV40 polyA in genome to be compatible with AAV titration in section 5.0 |
| Pump tubing | Cole-Parmer | RK-96440-14 | Optimize length of tubing and containment of virus in fractions E1-E5 |
| RQ1 Dnase 10 Reaction Buffer | Promega | M6101 | Use at 10x concentration in protocol from section 4.0 |
| RQ1 Rnase-free Dnase | Promega | M6101 | |
| Sample dilutent | Cygnus Technologies | I700 | Must be purchased separately for use with HEK293 host cell protein ELISA kit |
| Secondary antibody, HRP | Thermo Fisher Scientific | G-21040 | |
| Skim milk powder | Oxoid | LP0033B | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Thermo Fisher Scientific | 28312 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Thermo Fisher Scientific | SS266-4 | |
| SV40 polyA primer probe | IDT | Use sequence in Table X for quote from IDT for synthesis | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Thermo Fisher Scientific | 15524010 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Trypan blue | Bio-Rad | 1450021 | |
| Ultra-Filter | Millipore Sigma | UFC810024 | Ultra-4 Centrifugal 10K device must be used, as it has a 10000 molecular weight cutoff |
| Universal Nuclease for cell lysis | Thermo Fisher Scientific | 88702 | |
| Universal qPCR master mix | NEB | M3003L | |
| Whatman Paper | Millipore Sigma | WHA1001325 | |
| β-mercaptoethanol | Fisher Scientific | 21985023 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| CAUTION: Refer to the Materials Table for guidelines on the use of dangerous chemicals. |
References
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