Разработка боковой проточной иммунохроматографической полосы для быстрого и количественного обнаружения маломолекулярных соединений
Abstract
Мембранные иммунохроматографические полоски бокового потока (ICS) являются полезными инструментами для недорогой самодиагностики и эффективно применяются для обнаружения токсинов, физиологических индексов и клинических биомаркеров. В этом протоколе мы предоставляем подробное описание шагов по разработке быстрого, чувствительного и количественного бокового иммуноанализа (с использованием AuNPs в качестве маркера и mAbs в качестве зонда). Методика описывает получение и характеристику коллоидного золота, синтез конъюгата AuNP-mAb, сборку иммунохроматографической полосы, методологическое исследование анализа. Результаты показали, что конечные полоски могут быть дополнительно использованы для быстрой и удобной самодиагностики малой молекулы, что может обеспечить альтернативный инструмент в быстром и точном анализе физиологических и биологических показателей.
Introduction
Мембранные иммунохроматографические полоски бокового потока (ICS) являются полезными инструментами для недорогого и быстрого обнаружения. Нитроцеллюлозная мембрана в качестве носителя и коллоидное золото в качестве маркеров иммунохроматографических быстродиагностических реагентов являются наиболее часто используемым методом POCT (point of care testing), и объем тестирования проекта шире. Из их первоначального применения в мониторинге во время беременности их применение было расширено для контроля состояния свертываемой крови1,2,травмы миокарда3,ветеринарии4,остатков пестицидов5,инфекционных заболеваний6 и концентраций препарата. Можно оценить больше типов образцов, включая мочу, слюну, цельную кровь, сыворотку и другие жидкости организма7,8,9.
В последние годы были разработаны многочисленные новые анализы для выявления биомаркеров в диагностике расстройств, включая ВЭЖХ, UPLC, LC-MS и ELISA, которые являются чувствительными и точными, достоверными и специфическими. Однако эти методы требуют сложных инструментов, сложной предварительной обработки и трудоемких обработок9. Следовательно, разработка более быстрой и удобной диагностической стратегии в месте оказания медицинской помощи для самостоятельного обнаружения лекарственных активных соединений в режиме реального времени является неотложной10,11.
Популярность АСУ ТП, особенно для распространенных тестов, обусловлена их простотой использования, так как они не требуют профессионалов или сложных инструментальных установок12. Другими словами, люди, не имеющие специальной подготовки, могут оперировать полосками или самотестами13. Результаты теста могут быть получены за 5 минут, что означает, что его можно использовать для осмотра на месте14. Более того, по нашим расчетам, стоимость полосок может быть ниже 115 юаней,а это значит, что тесты недорого продвигать16. Следовательно, ICS является относительно точным, простым и недорогим одноразовым устройством. ICS на основе коллоидного золота17,18 также применяются при быстром выявлении COVID-19.
Принцип ICS можно разделить на сэндвич ICS и конкурентный ICS. Рисунок 1А представляет собой принципиальную схему сэндвич-ICS, которая в основном используется для обнаружения макромолекулярных веществ, таких как белки, включая опухолевые маркеры, воспалительные факторы и хорионический гонадотропин человека (ХГЧ, антиген ранней беременности). В этом методе используют парные антитела, нацеленные на разные эпитопы антигена, а захватное антитело сушат на мембране NC в качестве тестовой линии. Меченое антитело сушат на конъюгированной прокладке, а в качестве контрольной линии используют вторичное антитело.
Рисунок 1B представляет собой принципиальную схему конкурирующих АСУ ТП, которая в основном используется для обнаружения маломолекулярных веществ (MWCO < 2000 Da). Антиген покрытия фиксируют на мембране NC в качестве тестовой линии, а меченое антитело сушат на конъюгированной прокладке. Во время обнаружения образец и меченое антитело протекают через линию обнаружения под капиллярным действием, а покрытый антиген конкурентно связывает свободный антиген в образце и развивает красный цвет на линии обнаружения.
Недавно мы описали процедуру генерации моноклональных антител против натуральных продуктов19. В этой работе мы разработали новый анализ бокового потока на основе подготовленного анти-SSD mA20 для быстрого обнаружения на месте. Результаты показывают, что иммунохроматографический анализ является незаменимым и удобным инструментом для обнаружения соединений, полученных из натурального продукта.
Рисунок 1 Принципиальная схема иммунохроматографического анализа (А)Сэндвич иммунохроматографические тест-полоски. (B) Косвенные конкурентные иммунные хроматографические тест-полоски. Эта цифра была изменена с Zhang et al.,201821. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой работе мы представляем протокол получения mAbs против малых молекул, полученных из натурального продукта. Основные шаги и вопросы, требующие внимания в процедуре, были изложены, и мы продемонстрировали полезность этого протокола на примере SSD с малыми молекулами. Примеры спектров,…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Специальными фондами фундаментальных исследований высших учебных заведений, связанных с центральными департаментами. Мы ценим поддержку Группы фундаментальных исследований классических рецептов Пекинского университета китайской медицины.
Materials
| Chloroauric acid solution (HAuCl4) | Tianjin Fu Chen Chemical Reagents Factory | JY-SJ102 | |
| bovine serum albumin | AMRESCO | 332 | |
| centrifuge tube 15 mL | Corning | 430645 | |
| centrifuge tube 50 mL | Corning | 430828 | |
| ELISA plates, 96 well | NUNC | 655101 | |
| Filter paper | Sinopharm | H5072 | |
| Glass fibre membranes | Jieyi | XQ-Y6 | |
| goat-anti-mouse IgG antibody | applygen | C1308 | |
| Nitrocellulose membranes | Millipore | millipore 180 | |
| ovalbumin | Beijing BIODEE | 5008-25g | |
| PEG20000 | Sigma Aldrich | RNBC6325 | |
| Pipette 10mL | COSTAR | 4488 | |
| Pipette 25mL | FALCON | 357525 | |
| semi-rigid PVC sheets | Jieyi | JY-C104 | |
| Sodium citrate | Beijing Chemical Works | C1034 | |
| sodium periodate | Sinopharm Chemical | BW-G0008 | |
| Sulfo-GMBS | Perbio Science Germany | 22324 | |
| TipOne Tips 1,000 µL | Starlab | S1111-2021 | |
| Tris-HCl | Solarbio | 77-86-1 | |
| TWEEN 20 | Solarbio | 9005-64-5 |
References
- Huang, X., et al. Membrane-based lateral flow immunochromatographic strip with nanoparticles as reporters for detection: A review. Biosensors and Bioelectronics. 75, 166-180 (2016).
- Chang, H. -. F., Wang, J. -. Q., Wang, B., Deng, A. -. P. An immune chromatographic assay for rapid and simultaneous detection of levonorgestrel and methylprednisolone in water samples. Chinese Chemical Letters. 24 (10), 937-940 (2013).
- Lai, J. J., Stayton, P. S. Improving lateral-flow immunoassay (LFIA) diagnostics via biomarker enrichment for mHealth. Methods in Molecular Biology. 1256, 71-84 (2015).
- Zhang, M. Z., et al. Development of a colloidal gold-based lateral-flow immunoassay for the rapid simultaneous detection of clenbuterol and ractopamine in swine urine. Analytical & Bioanalytical Chemistry. 395 (8), 2591-2599 (2009).
- Kranthi, K. R., et al. Development of a colloidal-gold based lateral-flow immunoassay kit for ‘quality-control’ assessment of pyrethroid and endosulfan formulations in a novel single strip format. Crop Protection. 28 (5), 428-434 (2009).
- Qian, K., et al. Development and evaluation of an immunochromatographic strip for rapid detection of capsid protein antigen p27 of avian leukosis virus. Journal of Virological Methods. (221), 115-118 (2015).
- Guo, H., et al. Lateral flow immunoassay devices for testing saliva and other liquid samples and methods of use of same. US Patent. , (2003).
- Miočević, O., et al. Quantitative Lateral Flow Assays for Salivary Biomarker Assessment: A Review. Frontiers in Public Health. 5, 1-13 (2017).
- Lisa, M., et al. Gold nanoparticles based dipstick immunoassay for the rapid detection of dichlorodiphenyltrichloroethane: an organochlorine pesticide. Biosensors and Bioelectronics. 25 (1), 224-227 (2009).
- Zhang, Z., et al. Monoclonal Antibody-Europium Conjugate-Based Lateral Flow Time-Resolved Fluoroimmunoassay for Quantitative Determination of T-2 Toxin in Cereals and Feed. Analytical Methods. 7 (6), 2822-2829 (2015).
- Shen, H., et al. Facile synthesis of high-quality CuInZnxS2+x core/shell nanocrystals and their application for detection of C-reactive protein. Journal of Materials Chemistry. 22 (35), 18623-18630 (2012).
- Xiang, T., et al. A novel double antibody sandwich-lateral flow immunoassay for the rapid and simple detection of hepatitis C virus. International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1041-1047 (2012).
- Yang, Q., et al. Quantum dot-based immunochromatography test strip for rapid, quantitative and sensitive detection of alpha fetoprotein. Biosensors & Bioelectronics. 30 (1), 145 (2011).
- Song, L. W., et al. Rapid fluorescent lateral-flow immunoassay for hepatitis B virus genotyping. Analytical Chemistry. 87, 5173-5180 (2015).
- Zhang, Y., et al. Quantum dot-based lateral-flow immunoassay for rapid detection of rhein using specific egg yolk antibodies. Artificial Cells, Nanomedicine, and Biotechnology. 1, (2017).
- Qu, H., et al. Rapid Lateral-Flow Immunoassay for the Quantum Dot-based Detection of GsRerarin. Biosensors and Bioelectronics. 81, 358-362 (2016).
- Li, Z., et al. Development and Clinical Application of a Rapid IgM-IgG Combined Antibody Test for SARS-CoV-2 Infection Diagnosis. Journal of Medical Virology. 92 (9), (2020).
- Xiaomei, L., Jing, W., Ya, Z. The clinical application value analysis of the 2019-coronary virus disease was analyzed by the whole blood Sars-COV 2 specific antibody detection. Natural Science Edition. 42, (2020).
- Zhang, Y., et al. Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products. Journal of Visualized Experiments. , e57116 (2019).
- Sai, J., et al. Development of an Enzyme-Linked Immunosorbent Assay and Immunoaffinity Column Chromatography for Saikosaponin d Using an Anti-Saikosaponin d Monoclonal Antibody. Planta Medica. 82, 432-439 (2016).
- Yue, Z., et al. A Highly Sensitive Immunochromatographic Strip Test for Rapid and Quantitative Detection of Saikosaponin d. Molecules. 23 (2), 338 (2018).
- Qu, H., et al. Rapid Lateral-Flow Immunoassay for the Quantum Dot-based Detection of Puerarin. Biosensors and Bioelectronics. 81, 358-362 (2016).
- Zhang, Y., et al. Quantum dot-based lateral-flow immunoassay for rapid detection of rhein using specific egg yolk antibodies. Artificial Cells, Nanomedicine, and Biotechnology. 1, (2017).
